布里亞特頓金斯克區發酵乳制品中乳酸菌分離鑒定

黨娜，劉逸群，武岳，史迪，劉文俊，孫天松

（內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室呼和浩特010018）

0 引 言

每個國家與民族都有獨具特色的傳統發酵乳制品，俄羅斯布里亞特地區傳統發酵乳制品的品種豐富，味道鮮美，深受其它國家的喜愛[1-2]。傳統發酵乳制品的制作早已經歷了幾千年的傳承，再加上工藝條件、環境、地理因素等的不同，使其成為了蘊涵復雜乳酸菌資源的優良載體[3-4]。乳酸菌等多種微生物對乳制品的口味、質地、營養特性和儲藏特性具有很大程度的影響[5-7]。此外，乳酸菌可以改善胃腸功能、增強免疫力、緩解過敏、降血脂等[8-9]。本文對布里亞特共和國頓金斯克區發酵乳制品中乳酸菌的組成與種類進行研究，不僅可以為傳統發酵乳制品中乳酸菌多樣性研究提供原始數據，而且能夠豐富我國的乳酸菌菌庫，同時為優良乳酸菌篩選與工業應用提供菌株資源。

1 實 驗

1.1 材料

1.1.1 樣品來源及采集

本研究所用8份樣品于2016年9月采集,采集樣品信息如表1所示。用無菌勺將樣品放入無菌螺口采樣管（0.5 g，M淀粉∶MCaCO3=50∶1），寫好樣品號立即放置在低溫保存，盡快將樣品運回實驗室[10]。

表1 俄羅斯布里亞特共和國頓金斯克區采集樣品信息

1.1.2 試劑與儀器

CM1175，M.R.S.BRO TH和 CM1163，M.R.S.AGAR，英國OXO ID公司。提取基因組DN A、16S rRNA基因的PCR擴增、電泳檢測用的緩沖液和試劑參考文獻[11]。儀器設備及廠家信息參考文獻[12]。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌計數及分離純化

10倍稀釋法進行梯度稀釋，乳酸菌計數和分離分別采用傾注法、涂布法[13]。計數板和涂布板培養條件：37℃，厭氧，48 h。計數板進行計數；從涂布板上挑選出菌落形態明顯不同的單菌落，并記錄其菌落形態，如顏色、形狀、大小等，劃線純化培養物[14]。經革蘭氏染色，過氧化氫酶觸試驗，將疑似乳酸菌的純培養物進行保藏，以待后續試驗[15]。

1.2.2 基因組DNA提取及16S rRNA基因的PCR擴增

提取菌株基因組DNA試劑盒：TIAN am pBacteria DNA Kit（北京天根生化科技有限公司）。

PCR擴增體系：DN A tem p late（100 ng/μL）2μL，10×Bu ffer（Mg2+）5μL，d N TPs（2.5 mm o l/L）4μL，DNA r-Taq enzym e（5 U/μL）0.5μL，FA-27F（10mm ol/L）1.5μL，RA-1495R（10 mm o l/L）1.5μL，三蒸水35.5μL[16]。前后引物為通用引物，參考文獻[17]。

PCR擴增條件：首先94℃預變性5 min；然后94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸2 min（30個循環）；最后72℃末端延伸10min[18]。

1.2.3 16S rRNA序列測定、同源性比對和系統發育樹的構建

PCR產物雙向測序（上海桑尼生物技術有限公司），首先用SepMan（DNAStar 6.1）軟件整理、拼接、校準序列。然后把同源性大于99%作為種的鑒定閾值，用BLAST軟件（http://blast.ncbi.n lm.nih.gov/Blast.cgi）在數據庫（GenBank/EMBL/DDBJ）進行同源性比對[19]。最后用Mega 6.0軟件構建系統發育樹[20-21]。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌計數及分離結果

由表2可知，奶酪樣品中乳酸菌數（對數值）為（7.07±0.02）m L-1及（8.01±0.08）m L-1，結果與Bao Q iuhua對四川曲拉及甘肅牦牛乳曲拉（曲拉與奶酪生產工藝相似）計數結果相近，平均乳酸菌數為（7.18±1.49）m L-1[14]及（7.9±0.89）m L-1[22]。乳清樣品中乳酸菌數在7.75～7.89 m L-1之間。酸牛奶及發酵乳飲料樣品活菌數在6.88～8.90 m L-1之間，滿足新酸奶國家標準。所有樣品的活菌數都處于106m L-1以上，滿足國家衛生標準，也達到了酸奶國家標準。

表2 俄羅斯布里亞特共和國頓金斯克區樣品中乳酸菌的計數結果（對數值）

根據菌落的形態特征、革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，初步將50株菌定為乳酸菌。在涂布板上菌落形狀呈圓形、大小中等，中心凸起，顏色為白色或乳白色，邊緣整齊，表面有的光滑，有的粗糙。

2.2 菌株DNA提取及16S rRNA基因擴增結果

所有菌株DN A的OD 260/280值均在1.8～2.0之間，為純的DNA。將提取的DNA濃度稀釋至100 ng/μL進行16S rRNA基因擴增。擴增產物用1.0%AGE（瓊脂糖凝膠電泳）檢測之后，能看到在大約1 500 bp位置處有條清晰明亮的條帶且無彌散現象，如圖1。

圖1 部分分離株16S rDNA的PCR產物凝膠電泳圖

2.3 系統發育樹的構建及乳酸菌鑒定結果

由圖2可知，菌株BL4-11與模式株Pediococcus acidilactici DSMZ 20284T聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為Pediococcus acidilactici。菌株BL1-6與模式株Pediococcus pentosaceus ATCC 33316T聚為一類且同源性高達100%，將其鑒定為Pediococcus pentosaceus。菌株BL12-8與模式株Lactobacillus plantarum ATCC 14917T聚為一類且同源性為100%，故將其鑒定為Lactobacillus plantarum。菌株BL16-2與模式株Lactobacillus paracasei ATCC 25302T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Lactobacillus paracasei。菌株BL23-9-1與模式株Leuconostocmesenteroides JCM6124T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Leuconostoc mesenteroides。菌株BL13-10與模式株Streptococcus thermophilus ATCC 19258T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Streptococcus thermophilus。菌株BL15-2與模式株Lactococcus lactis ATCC 19435T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Lactococcus lactis。菌株BL15-12與模式株Enterococcus italicus DSM15952T聚為一類且同源性為100%，故將其鑒定為Enterococcus italicus。菌株BL13-1與模式株Enterococcus faecalis NBRC 100480T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Enterococcus faecalis。菌株BL5-1-1與模式株Enterococcus durans NBRC 100479T聚為一類且同源性為100%，將其鑒定為Enterococcus durans。菌株BL5-2與模式株Enterococcus faecium NBRC 100485T聚為一類且同源性為100%，因此將其鑒定為Enterococcus faecium。

圖2 布里亞特共和國頓金斯克區部分菌株的16S rDNA序列的系統發育樹

2.4 優勢菌種分析

布里亞特共和國頓金斯克區傳統乳制品中乳酸菌的分離結果如表3所示。除了奶酪1（GAL1）以外，所有的樣品均分離到Lactococcus lactis，占總分離株的40%，為布里亞特共和國頓金斯克區傳統發酵乳制品的優勢菌種。其次乳清4和乳清12（TUN 4和TUN 12）中均分離到Lactobacillus plantarum，共7株，占總分離株的14%，為布里亞特共和國頓金斯克區乳清的優勢菌。奶酪1（GAL1）、乳清4（TUN 4）、發酵乳飲料13（TOR 13）分離的菌種類別最多，都有5種。由于本次采樣酸牛奶23（SAG 23）采樣量較少且未進行全面采樣，因此其分離的菌種類別和數量會比較少，在今后的研究中需進行改善。綜上所述，布里亞特共和國頓金斯克區發酵乳制品的優勢種為Lactococcus lactis，占總分離株的40%。

表3 布里亞特共和國頓金斯克區傳統乳制品中乳酸菌的分離結果

3 討 論

本文對俄羅斯布里亞特共和國頓金斯克區的傳統奶酪樣品進行乳酸菌分離鑒定，分離株分別歸屬于Enterococcus、Lactobacillus、Leuconostoc等菌屬，這與楊彥榮的結果符合，楊彥榮等[16]研究的卡爾梅克傳統奶酪中乳酸菌分別歸屬于Enterococcus、Lactobacillus和Leuconostoc3個菌屬。不同的環境條件下，傳統發酵奶酪的菌群組成是不同的：Aydemir等[23]研究的奶酪優勢菌為Lactobacillus casei和 Lactobacillus plantarum；Do lci等[24]研究的Castelm agno PDO奶酪優勢菌為Lactobacillus plantarum和Lactobacillus paracasei；Coppo la R等[25]研究的Caciocavallo奶酪優勢菌為Lactobacillus pentosus和Lactobacillus coryneformis subsp.Torquens；Coppo la S等[26]研究的Mozzarella奶酪優勢菌為Streptococcus thermophilus；PIRAINO P等[27]研究的奶酪優勢菌還有Lactobacillus fermentum。本研究從酸牛乳中分離出的乳酸菌被鑒定為 3個屬Lactococcus、Enterococcus和 Leuconostoc，其中 Lactococcus lactis為該地區酸牛乳中的優勢種。卿蔓君[28]研究內蒙古東部地區發酵酸牛乳中發現Lactococcus lactis subsp.lactis、和 Leuconostocmesenteroides subsp.Mesenteroides為其中的優勢菌株。雷霞[29]研究內蒙古伊敏河岸、海拉爾河岸牧區發酵乳發現乳酸菌歸屬于4個屬，Lactobacillus、Lactococcus、Enterococcus和 Leuconostoc，其 中Lactobacillus plantarum和Lactococcus lactis subsp.lactis為該地區傳統乳中的優勢菌群。本研究乳清中分離到的乳酸菌被鑒定為4個屬（Lactococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Pediococcus）5個種，其中Lactobacillus plantarum為該地區乳清中的優勢種，其次是Lactococcus lactis。本研究發酵乳飲料中分離到的乳酸菌被鑒定為5個屬（Lactococcus、Enterococcus、Lactobacillus、Pediococcus、Steptococcus）6個種，其中Lactococcus lactis為該地區發酵乳飲料中的優勢種，這與呼斯楞的結果相符合，呼斯楞[30]運用與本文一樣的研究方法得出內蒙古呼倫貝爾地區液體發酵乳制品中的優勢菌種為Lactococcus lactis。海拔、氣候、溫度、大氣壓、陽光等各種環境因素的差異以及乳制品的制作工藝條件和制作環境等因素也影響成品的菌群結構，在所有因素的綜合作用下，不同地區的不同乳制品都具有了獨特性[7,31]。

目前在發酵乳制品生產中涉及的乳酸菌屬有Lactococcus、Lactobacillus、Pediococcus、Leuconostoc、Streptococcus、Bifidobacterium[32]。布里亞特共和國頓金斯克區8份發酵乳制品中分離到的50株乳酸菌鑒定為6個菌屬，包括上述的前5個乳酸菌屬（沒有分離到Bifidobacterium），還有Enterococcus。Enterococcus一直存在于眾多的發酵乳制品中，在乳制品中經常會分離到Enterococcus faecalis和Enterococcus faecium，Enterococcus durans也經常在奶制品中分離出來，但在發酵過程中的應用仍存在爭議。有研究表明，Lactococcus和Streptococcus這兩個菌屬的某些菌株有助于乳制品的酸化、凝乳以及酪蛋白水解過程[33]。Streptococcus thermophilus可以對乳酸發酵的生態環境進行改善，而且可以降低膽固醇水平[34]。Lactococcus lactis具有快速酸化以及凝乳的能力，能夠通過促進乳酸的形成進而增強乳制品的風味及質地[7,35]。Leuconostoc與Enterococcus能夠對乳制品的味道和質地產生影響[36]。Lactobacillus中瑞士乳桿菌憑借其蛋白水解能力可以減少某些乳制品，如奶酪等的苦味[37]。

4 結 論

本文從俄羅斯布里亞特共和國頓金斯克區采集的8份傳統發酵乳制品樣品中乳酸菌數（對數值）為（6.88±0.19）m L-1至（8.90±0.30）m L-1，乳酸菌活菌數都比較高。采用傳統純培養方法分離得到50株菌株，然后通過16S rDNA序列分析方法將其鑒定為Lactococcus，Lactobacillus，Enterococcus，Pediococcus，Leuconostoc，Streptococcus，共6個屬，11個種。其中，Lactococcus lactis分離到20株，占總菌株的40%，為布里亞特共和國頓金斯克區傳統發酵乳制品中的優勢菌種。