新型鈦表面微納米共存梯度仿生結構對骨髓間充質細胞黏附、增殖及成骨分化的影響

王旻， 姜楠， 祝頌松

口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫學研究中心 四川大學華西口腔醫院口腔醫院頜面外科，四川 成都（610041）

骨內植入體在整形外科和牙科應用十分廣泛［1-2］。低彈性模量的純鈦或鈦合金是目前植入體的首選材料［3］。但鈦及鈦合金屬于生物惰性材料，直接植入常無法獲得良好快速的骨結合，制約了其更為廣泛的應用。骨結合是骨內植入體植入成功的標志［4］，細胞在種植體表面黏附、增殖是種植體與周圍組織作用的關鍵環節，通過影響細胞黏附、增殖、分化等細胞反應最終影響植入體骨結合性能［5-7］。如何通過種植體表面改性促進成骨細胞早期黏附，縮短植入體骨結合時間，增強骨結合強度，仍然是口腔種植體領域研究熱點［8-10］。研究證實，通過電化學陽極氧化形成的納米級表面形貌可以促進成骨細胞在植入體表面的早期附著［11］。同時，骨具有微納米級共存的梯度結構［12］，從仿生角度，具有微納米級共存的梯度仿生表面結構更利于植入體-周圍骨組織營養運輸和骨引導生長［13］。目前，鈦材如何在三維空間中影響細胞-植入體的相互作用尚未達到共識。本研究制備一種新型微納米共存的梯度仿生表面結構，即在微米骨小梁樣結構上制備TiO2納米管結構，并研究其對體外大鼠骨髓間充質細胞（bone marrow mesenchymal cells，BMMCs）增殖、黏附及成骨向分化潛能的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料、試劑及儀器

純鈦材料（中國科學院金屬研究所）；SPS-1050放電等離子燒結系統（Thermal Technology LLC，SantaRosa，CA，美國）；PGSTAT302N 電化學工作站（Metrohm，中國）；4 周大雄性SD 大鼠（SYXK（川）2018-185）由四川大學動物實驗中心提供；10%水合氯醛（四川大學華西婦產兒童醫院）；胰蛋白酶、胎牛血清、α-MEM 培養基（Gibco，美國）；MTT（Sigma-Aldrich，美國）；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）檢測試劑盒（Beyotime，中國）；DAPI 染色液（碧云天生物科技有限公司）；DyLight 549 標記的山羊抗兔二抗IgG、DyLight488 標記的山羊抗鼠二抗IgG、兔抗鼠骨鈣素（osteocalcin，OCN）抗體、鼠抗鼠骨橋蛋白（osteopontin，OPN）抗體、Alex Fluor647 標 記 的Anti-Vinculin 抗 體、FITC-phalloidin（Millipore，美國）；引物（Invitrogen，美國）、SYBR 定量PCR 試劑盒（Takara，日本）；掃描電子顯微鏡（Inspect F，FEI，荷蘭）；原子力顯微鏡（Nanoscope Multi Mode & Expolre SPM，Vecco Instrument，美國）；倒置熒光顯微鏡（Olympus，日本）；TL101 接觸角分析儀（TL101，Biolin scientific，瑞典），cDNA 試劑盒（Takara，日本）。

1.2 材料制備及表征觀察

1.2.1 材料制備 將純鈦試樣預處理，依次用丙酮、去離子水超聲清洗10 min，高溫蒸汽滅菌后備用，命名為純鈦組。一組純鈦試件表面行放電等離子燒結處理，制備微米骨小梁樣形貌，命名為微米骨小梁組；一組純鈦試件表面行陽極氧化處理，制備TiO2納米管形貌，命名為TiO2納米管組；一組純鈦表面首先通過放電等離子燒結法制備微米骨小梁樣形貌，再通過陽極氧化法在微米骨小梁形貌上制備TiO2納米管結構，形成新型微納米共存梯度仿生表面結構，命名為微納米復合鈦組。

1.2.2 表征觀察 ①表面形貌：掃描電子顯微鏡觀察4 組材料表面形貌，通過原子力顯微鏡進一步觀察純鈦組和TiO2納米管組表面形貌，使用Nanoscope Multi Mode 圖形分析軟件對樣品表面的表面平均粗糙度均方根、表面積差值（三維表面積比二維表面積的比值增加的百分比）、垂直距離等表面粗糙度指標進行定量分析。

②表面能：利用靜態水接觸角實驗檢測不同植入材料表面能，每個樣本表面隨機選取5 個點進行測量。

1.3 體外實驗

1.3.1 大鼠骨髓間充質細胞分離和培養 取4 周大雄性SD 大鼠，10%水合氯醛腹腔注射麻醉后頸椎脫臼處死，浸泡于75%酒精。迅速分離脛骨和腓骨周圍的皮膚、肌肉等結締組織，將股骨和脛骨置于1%雙抗溶液中。在無菌條件下，剪去股骨及脛骨的骨垢端，用無菌注射器吸取培養基沖洗骨髓腔獲得細胞懸液，1 000 r/min 離心5 min 后用含10%胎牛血清的α-MEM 培養基重懸，記為P0。37 ℃、體積分數為5%CO2、飽和濕度的細胞培養箱孵育。48 h 后首次換液，更換新鮮培養基，隔日換液，待細胞生長至80%～90%融合時按1∶3 傳代培養。在細胞超凈臺中，將第2～4 代BMMCs 以5 ×104/mL 細胞密度接種于4 組植入材料表面，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養。在不同時間點進行如下檢測。

1.3.2 細胞黏附情況 細胞接種2 h 后，PBS 清洗2 次，2.5%戊二醛固定30 min，依次用20%、40%、60%、80%、90%酒精以及無水乙醇梯度脫水，每個梯度脫水10 min。將樣本輕輕粘在導電膠上，臨界點干燥、真空噴鍍，行掃描電鏡觀察。

1.3.3 細胞增殖能力（MTT 法） 細胞接種于4 組材料表面1、3、5、7、9 d 后，PBS 清洗，每孔加入10 mg/mL 的MTT 10 μL，37 ℃培養箱中孵化4 h，棄掉上清液，每孔再加入二甲亞砜150 μL，室溫下孵育15 min 充分震蕩溶解沉淀，使用酶聯免疫檢測儀檢測OD590nm。每組樣本在每個時間點選4 個平行樣進行檢測，以純鈦組接種細胞第1 天檢測的結果為參照，計算各組細胞相對增殖率。

1.3.4 堿性磷酸酶檢測 鈦材樣品接種細胞24 h后，將培養基更換為成骨誘導液（含體積分數10%的胎牛血清，地塞米松100 nmol/L、抗壞血酸50 mg/L、β-甘油磷酸鈉10 mmol/l 的α-MEM 培養液）。每48 h 換液1 次。培養7、10、14 d 后，PBS 清洗3 次，每孔加入0.2%Triton-X-100 裂解液400 μL，放置4 ℃過夜。次日細胞裂解液50 μL 和50 μL 對硝基苯 磷 酸 鹽（p-nitrophenyl phosphate，PNPP）孵 育30 min 后每孔加入100 μL 反應終止液終止反應，使用酶聯免疫檢測儀在OD405nm。同時按照BCA蛋白定量試劑盒說明書操作測定總蛋白濃度。每組樣本在每個時間點選4 個平行樣進行檢測。

1.3.5 免疫熒光檢測細胞黏著斑蛋白、成骨分化相關蛋白表達 接種24 h 后，PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，0.2%Triton X-100 通透15 min，避光、4 ℃條件下Alex Fluor647 標記的Anti-Vinculin 抗體、FITC-phalloidin 對各組表面上附著的細胞進行染色并過夜。

接種72 h 后，PBS 清洗3 次，4%多聚甲醛固定30 min，0.2% Triton X-100 通透細胞膜15 min，觀察OCN、OPN 表達。一抗孵育：吸水紙吸掉封閉液，每張爬片上滴加足夠量稀釋好的一抗（OCN 1∶200；OPN 1∶200）并放入濕盒，4 ℃過夜；二抗孵育：取出濕盒，37 ℃下復溫45 min，PBS 清洗爬片3 次，吸水紙吸掉殘留的PBS，滴加稀釋好的DyLight 549標記的二抗Ig G（1∶500）、DyLight488 標記的二抗IgG（1∶500）。

最后均用DAPI 避光染色5 min。激光共聚焦顯微鏡（confocal laser scanning microscopy，CLSM）下觀察。

1.3.6 qRT-PCR 檢測成骨標志基因表達 細胞接種7 d 后，用Trizol 試劑提取總RNA，使用1 步法cDNA 試劑盒逆轉錄成cDNA，再行qRT-PCR 檢測。引物序列如表1 所示。PCR 反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，運行40 個循環，目的基因表達均依據管家基因GAPDH 表達水平進行標準化處理后進行比較，根據2-△△Ct法對成骨標志基因：RUNX2、OCN、OPN 和I 型膠原（collagen type I，COL I）進行基因相對表達倍數轉化。

1.4 統計學分析

采用IBM SPSS 19.0 軟件進行數據分析，結果均以±s來表示，采用單因素方差分析及q檢驗進行組間比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

表1 PCR 引物序列Table 1 Specific prime sequences of PCR

2 結 果

2.1 樣品表征

2.1.1 材料表面形貌特點分析 掃描電子顯微鏡下純鈦組表面僅見機械打磨的痕跡（圖1a）；微米骨小梁組表面形成微米骨小梁樣表面形貌，有些微米管之間互相交通（管徑30～100 μm），類似骨小梁結構（圖1b）；TiO2納米管組表面形成均一排列的TiO2納米管樣結構（圖1c、圖1d）；微納米復合鈦組表面形成微米骨小梁結構上有均一排列TiO2納米管的新型梯度仿生表面結構。原子力顯微鏡下可見純鈦組表面光滑，沒有明顯的孔洞或任何規則的形狀；TiO2納米管組納米孔近似圓形，直徑從十幾納米至上百納米不等，納米孔深度從十幾至幾十納米不等（圖2）。AFM 粗糙度的定量分析結果見表2，TiO2納米管組表面比純鈦組粗糙（P＜0.001），TiO2納米管組表面粗糙度、輪廓最大高度偏差、表面積差值分別約為純鈦組的2.9 倍、2.2 倍、1.9 倍。

Figure 1 SEM images of the surface of titanium samples圖1 材料表面形貌掃描電鏡觀察

2.1.2 材料表面的表面能檢測 4 組材料表面的表面能檢測結果顯示（圖3）：靜態水接觸角分別為35° ± 2.3°（純鈦組）、18° ± 1.6°（微米骨小梁組）、14° ± 1.6°（TiO2納米管組）和9° ± 2.1°（微納米復合鈦組）。微納米復合鈦組的靜態水接觸角最?。≒＜0.001），說明其表面親水性最好。

2.2 體外材料表面細胞行為

2.2.1 細胞黏附情況 4 組材料表面接種4 h 后細胞黏附情況顯示，純鈦組細胞多呈梭形，部分可見偽足和觸角（圖4a）。微米骨小梁組細胞呈扁平多角形，可明顯見偽足和觸角（圖4b）。TiO2納米管組細胞扁平多角形，緊密附著在材料表面（圖4c）。微納米復合鈦組細胞伸展更加充分，細胞與細胞間相互交織連接，大多成片，可見大量偽足和觸角（圖4d）。

Figure 2 AFM images of samples in the untreated-Ti group and nano-TiO2 group圖2 純鈦組和TiO2納米管組表面AFM 掃描圖

表2 純鈦組和TiO2納米管組表面參數比較Table 2 Surface parameters of samples in the untreated-Ti group and nano-TiO2 group

2.2.2 細胞增殖能力（MTT） BMMCs 接種4 組材料表面增殖活性MTT 檢測結果如圖5 所示。接種后1～9 d 細胞增殖活性呈遞增趨勢，但1 d 和3 d 差異無統計學意義（P＝0.278），結果表明，1～4 d，微納米復合鈦組和TiO2納米管組細胞增殖活性高于純鈦組和微米骨小梁組，但差異沒有統計學意義。5～9 d，微納米復合鈦組和TiO2納米管組的細胞增殖活性顯著高于純鈦組和微米骨小梁組（P＜0.001）。

Figure 3 The static contact angles on the samples in the four groups圖3 4 組材料表面靜態接觸角

Figure 4 SEM images of BMMCs 4 h after culture on the surfaces of samples in the four groups圖4 骨髓間充質細胞接種于4 組鈦材表面4 h 后的掃描電鏡圖

Figure 5 The cell proliferation rate of BMMCs cultured on the samples in the four groups圖5 BMMCs 接種于4 組材料表面后的細胞相對增殖率

2.2.3 ALP 活性 BMMCs 接種4 組材料表面7、10、14 d ALP 活性檢測結果如圖6。細胞在4 組材料表面ALP 活性在7～14 d 呈遞增趨勢。10 d 和14 d時，TiO2納米管組和微納米復合鈦組表面細胞ALP活性明顯高于純鈦組（P＜0.001）。14 d 時，微納米復合鈦組表面ALP 活性最高，說明微納米復合鈦表面促進骨髓間充質細胞成骨向分化。

2.2.4 細胞黏附、成骨分化相關蛋白表達 培養24 h 后，純鈦組黏著斑蛋白染色較微米骨小梁組、TiO2納米管組和微納米復合鈦組淺，微米管組、TiO2納米管組和微納米復合鈦組之間無明顯差異；TiO2納米管組和微米骨小梁組中肌動蛋白染色深于純鈦組，微納米復合鈦組肌動蛋白染色最深（圖7a）。培養72 h 后，純鈦組表達OCN 和OPN 最弱，微納米復合鈦組表達OCN，OPN 比微米骨小梁組和TiO2納米管組強（圖7b）。

2.2.5 qRT-PCR 檢測成骨標志基因表達 TiO2納米管組和微納米復合鈦組表面細胞所有成骨轉錄因子的基因表達水平高于純鈦組和微米骨小梁組，其中COL I 基因表達水平有顯著性差異（P＜0.001）。結果表明TiO2納米管組和微納米復合鈦組促進BMMCs 早期成骨轉化。純鈦組的OPN 和OCN 基因表達水平最低，與細胞免疫熒光染色結果一致（圖8）。

Figure 6 ALP activity of BMMCs cultured on the samples in the four groups圖6 BMMCs 接種于4 組材料表面后的細胞ALP活性

3 討 論

骨結合是骨內植入體植入成功的標志，良好的骨結合說明人體骨組織與植入體表面形成直接穩定連接，有利于抗壓和負重［14］。植入體骨結合效果受其表面性質（如粗糙程度、表面形貌等）的影響，可以通過表面改性增強其骨結合性能，如放電等離子燒結、酸蝕、陽極氧化［15-17］。骨具有微納米級共存的梯度結構，從仿生角度，具有微納米級共存的梯度仿生表面結構更利于植入體-周圍骨組織營養運輸和骨引導生長。研究證實微納米復合鈦表面形貌骨結合性能優于微米管和TiO2納米管表面形貌［18］。本研究制備出一種新型微納米共存梯度仿生表面結構，首先通過放電等離子燒結法在純鈦表面制備微米骨小梁樣結構，再通過陽極氧化法在微米骨小梁樣結構上制備TiO2納米管結構，形成新型微納米共存梯度仿生表面結構，將BMMCs 接種于新型微納米共存梯度仿生表面結構表面，探究其對大鼠骨髓間充質細胞生物學活性的影響。

Figure 7 Immunofluorescence staining images of BMMCs cultured on the samples in the four groups （×400）圖7 BMMCs 接種于4 組材料表面的細胞免疫熒光染色圖 （×400）

Figure 8 mRNA expression levels of various osteogenic transcription factors in the four groups圖8 4 組成骨轉錄因子mRNA 表達

MTT 細胞增殖結果顯示，1～9 d，微納米復合鈦組和TiO2納米管組細胞增殖活性高于純鈦組和微米骨小梁組；5～9 d，微納米復合鈦組和TiO2納米管組的增殖活性顯著高于純鈦組和微米骨小梁組；提示聯合應用放電等離子燒結和陽極氧化處理的鈦表面表面接種的BMMCs 增殖活性更好。ALP 是成骨分化的早期標志，可水解磷酸離子，形成羥基磷灰石晶體并促進礦化［19］。成骨誘導10 d和14 d，TiO2納米管組和微納米復合鈦組表面細胞ALP 活性明顯高于純鈦組（P＜0.001），證實聯合應用放電等離子燒結和陽極氧化處理的鈦表面可促進BMMCs 成骨分化。

CLSM 結果示微納米復合鈦組和TiO2納米管組OCN、OPN 染色深于純鈦組和微米管組。qRT-PCR結果示TiO2納米管組和微納米復合鈦組表面細胞的RUNX2、OCN、OPN 和COL I 基因表達水平強于純鈦組和微米骨小梁組，I 型膠原表達水平有顯著性差異（P＜0.001）。結果表明微納米復合鈦組可促進細胞黏附、增殖以及成骨向分化。

綜上所述，聯合應用放電等離子體燒結和陽極氧化法在純鈦植入體表面制備的新型微納米共存的梯度仿生表面結構可促進骨髓間充質細胞的黏附、增殖及成骨向分化。下一步將進行動物體內實驗，進一步證實改性鈦表面的成骨活性。

【Author contributions】Wang M peformed the experiments，analyzed the data，and wrote the article. Jiang N revised the article. Zhu ZS designed the study. All authors read and approved the final manuscript as submitted.