NEDD8抑制劑MLN4924抑制肝細胞癌惡性表型的研究

邢曉華,袁 暉,趙必星

(福建醫科大學孟超肝膽醫院,福州 350025;*通訊作者,E-mail:heady@126.com)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC,簡稱肝癌)發病率高,死亡率高,是世界范圍內第四大惡性腫瘤[1]。目前手術切除是肝癌治療的首選方式,但預后仍不理想[2,3],因此,尋找新的抗腫瘤藥物是目前提高肝癌治療療效的首要任務。

神經前體細胞表達發育調控蛋白8(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated-8,NEDD8)是最早發現和研究的類泛素蛋白之一[4],由81個氨基酸組成,與泛素具有59%的一致性和80%的同源性[5,6]。NEDD8與底物蛋白共價結合的過程為NEDD8共價修飾(neddylation),與泛素化修飾過程類似,也被稱為類泛素化修飾。neddylation也需要經過活化酶1(enzyme 1,E1)、結合酶2(enzyme 2,E2)和連接酶3(enzyme 3,E3)催化將單個NEDD8分子共價連接到底物分子上,也是單個分子在底物上依次累加的過程[7]。

MLN4924是一種單磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)類似物,通過與NEDD8結合抑制結合酶E2與NEDD8的結合,從而抑制了neddylation的發生過程[8-10]。目前,已有研究證實MLN4924在實體惡性腫瘤和血液惡性腫瘤中具有明顯的抑癌作用,其作用機制主要是誘導DNA重新復制/損傷、誘導細胞凋亡/死亡/衰老和自噬、抑制血管生成等[11-13]。由于其在臨床前研究中具有良好的抗腫瘤功效和可耐受的毒性,MLN4924目前正在幾個Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗中進行研究用于腫瘤治療。但目前對于MLN4924在肝癌中發揮抗腫瘤效果的作用機制尚不明確,有待于進一步研究。

本研究旨在通過檢測MLN4924對肝癌細胞增殖、遷移侵襲等惡性表型及相關信號通路的影響,探討MLN4924抗腫瘤的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

Hep3B細胞購置于美國ATCC。NEDD8抑制劑MLN4924購于美國Selleck公司,CCK-8試劑盒購于Dojundo公司,Transwell小室購于美國Hyclone公司,β-actin,NEDD8,E-cadherin和N-cadherin等抗體購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及分組 Hep3B肝癌細胞株由含10%胎牛血清(Gibico,美國)的培養基,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養。當細胞密度達到80%時,0.25%胰酶消化,接種至傳代繼續培養。當細胞密度達到80%時,將細胞分為3組。MLN4924組使用1 μmol/L的NEDD8的抑制劑MLN4924處理細胞,陰性對照組使用等體積的DMSO處理,空白組不作任何處理,4 h后用預冷的PBS緩沖液清洗,加入RIPA細胞裂解液,用細胞刮刀快速刮下,吸入1.5 ml EP管,置于冰上。

1.2.2 蛋白提取及定量 將EP管置于超聲破碎儀中15 ℃功率30%超聲1 s,停止5 s超聲破碎8 min,全程細胞置于冰上,4 ℃,17 000g離心10 min,棄沉淀,將上清轉入新1.5 ml EP管;加入1 mol/L二硫蘇糖醇(DTT)至其終濃度為8 mmol/L,放入干式恒溫器55 ℃加熱30 min。冷卻后加入500 mmol/L碘乙酰胺(IAA)至其終濃度為50 mmol/L,放入抽屜室溫黑暗反應30 min,17 000g離心10 min,取上清備用。BCA法測定蛋白濃度后用于后續Western blot檢測。

1.2.3 Western blot檢測NEDD8表達,neddylation水平,以及E-cadherin和N-cadherin蛋白的表達水平 將上述提取的MLN4924組和陰性對照組細胞蛋白樣品用上樣緩沖液稀釋,17 000g離心10 min,取上清進行8%SDS-PAGE電泳;100 V恒壓冰浴轉印1 h至NC膜,5%BSA封閉4 h后孵育一抗(β-actin,NEDD8,E-cadherin和N-cadherin)4 ℃過夜;次日用TBST緩沖液清洗后孵育相應二抗,室溫反應1 h,TBST緩沖液清洗后進行ECL顯色,并在凝膠成像分析系統中曝光顯影。

1.2.4 CCK-8實驗檢測肝癌細胞的增殖能力 制備2×105個/ml的細胞懸液,分別加入1 μmol/L的NEDD8抑制劑MLN4924和等體積的DMSO處理作為實驗組和對照組,取100 μl接種于96孔板,每株細胞設置10個復孔;需測定細胞增殖情況時,加入10 μl CCK-8試劑,繼續培養2 h后用酶標儀檢測450 nm處的吸光值;種板后8 h開始測,并記為0 d,隨后分別測定1,2,3,4 d的吸光度;評估細胞增殖能力。

1.2.5 Transwell實驗檢測肝癌細胞的遷移和侵襲能力 細胞消化后用PBS清洗,離心后用不含血清的DMEM培養基重懸,調整細胞密度為1×105個/ml進行處理。遷移實驗用含基質膠的小室,加入200 μl處理的細胞至Transwell上室,下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM,放入24孔板于5% CO2、37 ℃培養箱中24 h;用預冷的4%多聚甲醛固定液固定,PBS清洗后用結晶紫染色,雙蒸水清洗數次后倒扣自然風干,然后在顯微鏡下每組隨機選擇5個視野進行拍照和細胞計數。侵襲實驗用含基質膠的小室進行,其余步驟與侵襲實驗相同。

1.2.6 細胞劃痕實驗檢測肝癌細胞的遷移能力 細胞劃痕實驗參照ibidi Culture-Inserts說明書給定的步驟進行。首先制備5×105個/ml的細胞懸液,在Culture-Inserts每一小格加入細胞懸液70 μl,5%CO2、37 ℃培養過夜;在Culture-Inserts外圍加200 μl培養基,培養24 h。用無菌鑷子夾著Culture-Inserts一角,輕輕移除,再用預熱PBS輕輕潤洗,加入2 ml不含血清的培養基,培養基中分別含1 μmol/L的NEDD8的抑制劑MLN4924和等體積的DMSO;在0,12,24 h于顯微鏡下拍照,以拔除Culture-Inserts記為0 h。

1.2.7 統計學分析 采用GraphPad Prism 6.0軟件進行統計分析及作圖,結果用平均數±標準差表示,兩組間比較采用t檢驗,P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MLN4924抑制肝癌細胞neddylation過程

Western blot結果顯示,與陰性對照組相比,MLN4924組中NEDD8本體含量增加,而neddylation,即NEDD8經共價修飾后分子量增加的部分減少(見圖1),說明MLN4924能抑制肝癌細胞neddylation的發生。

圖1 MLN4924對NEDD8蛋白表達及neddylation水平的影響

2.2 MLN4924抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲等惡性表型

與陰性對照組相比,MLN4924組中肝癌細胞的增殖能力受到抑制,兩組比較差異有統計學意義(P<0.000 1,見圖2)。Transwell細胞遷移驗結果顯示,MLN4924組中Hep3B細胞在Transwell小室中的遷移數量為176.00±13.60;而陰性對照組中遷移細胞數量為280.80±10.64,兩組比較差異有統計學意義(P<0.000 1,見圖2)。

與陰性對照比較，****P<0.000 1

細胞侵襲實驗結果顯示,MLN4924組Hep3B細胞的穿膜數量為101.80±12.66,而陰性對照組穿膜細胞數量為206.40±21.33,兩組比較差異有統計學意義(P<0.000 1,見圖3)。以上結果表明,MLN4924能顯著抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。同時,利用細胞劃痕實驗進一步檢測MLN4924對肝癌細胞遷移的影響,結果顯示:MLN4924組在劃痕后24 h肝癌細胞遷移率分別為(56.6±1.6)%,而陰性對照組的細胞遷移率為(64.8±2.3)%,兩組比較差異有統計學意義(P<0.01,見圖4)。以上結果進一步證實了MLN4924對肝癌細胞遷移能力具有明顯的抑制作用。

與陰性對照比較，****P<0.000 1

圖4 劃痕實驗檢測MLN4924對細胞遷移的影響

2.3 MLN4924抑制肝癌細胞EMT發生

與空白對照組相比,陰性對照組的細胞形態無明顯變化,均呈紡錘狀成纖維細胞形態,有偽足;而MLN4924組細胞形態發生比較明顯改變,細胞偽足消失,細胞縮小變圓呈上皮細胞形態,黏附性變低(見圖5)。結果提示MLN4924處理可能抑制了肝癌細胞的上皮間質轉化(EMT)過程。為了進一步驗證MLN4924對肝癌細胞EMT信號通路的作用,利用Western blot方法在蛋白水平直接檢測肝癌細胞的EMT相關的表型標志物N-cadherin和E-cadherin的蛋白表達水平。結果顯示,與對照組相比,MLN4924組的的間質標志物N-cadherin的表達降低,同時上皮標志物E-cadherin的表達升高(見圖6)。以上結果證實了MLN4924可抑制肝癌細胞的EMT轉換。

圖5 MLN4924對細胞形態的影響

與陰性對照比較，*P<0.05，***P<0.001

3 討論

FDA批準的第一個抑制泛素-蛋白酶體過程的藥物是硼替佐米,通過結合蛋白酶體抑制NF-κB信號通路從而殺傷細胞[14],目前已經推薦為套細胞淋巴瘤和多發性骨髓瘤的一線化療藥物[15,16]。但是目前硼替佐米依然存在比較大的比較普遍的不良反應,包括腹瀉、心功能損害等[17]。而MLN4924是特異性的NAE抑制劑,可以通過抑制neddylation過程中的NAE酶而抑制NEDD8激活,從而使主要底物Cullin家族蛋白不能被活化,因此可以起到和硼替佐米相同的效果。目前已有關于MLN4924在各種腫瘤的作用及相關機制的研究,MLN4924可以通過抑制UBE2M抑制腎癌細胞增殖,并且抑制其遷移侵襲[9]。也可以抑制胃癌細胞的增殖與遷移[18]。而在肝癌中雖有報道其可以通過促進肝癌保護性自噬促進肝癌細胞凋亡[19,20],但其對肝癌細胞侵襲轉移的詳細機制研究目前尚不清楚,有待于進一步研究。

在本文中,我們發現肝癌細胞株Hep3B經MLN4924處理之后,NEDD8的本體增加,而細胞內特異性類泛素化neddylation廣泛地受到抑制,由此證明MLN4924可以直接抑制NEDD8的功能。而之后的實驗結果證實,MLN4924抑制肝癌細胞的增殖,這與報道的一致。另外,我們還證實了MLN4924也可以明顯抑制肝癌細胞的遷移和侵襲。而后我們觀察到在MLN4924的影響下,肝癌細胞形態明顯發生改變,由原有的偽足形成且紡錘狀成纖維細胞形態縮小變圓,呈上皮細胞形態,且偽足消失。證明肝癌細胞的黏附性降低,由此推測MLN4924可能抑制了肝癌細胞的上皮間質轉化(EMT)過程。而后我們檢測了MLN4924處理后肝癌細胞中EMT相關分子標志物的表達變化,發現E-cadherin分子表達明顯上升,而N-cadherin分子表達明顯下降,說明NEDD8確實可以通過提高細胞E-cadherin表達來促進肝癌細胞的EMT。

本研究證實MLN4924可以顯著抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲等惡性表型。并且MLN4924處理后的肝癌細胞的黏附性降低。并且進一步證明了MLN4924可抑制EMT信號通路。但是腫瘤的發生發展是一個多因素、多步驟的過程,機制錯綜復雜,具體的內在機制需要我們進一步的深入研究。