Src激酶抑制劑PP2對癲癇持續狀態性大鼠腦水腫形成及ERK1/2和P38信號通路的影響

楊子茵,李 寧,黃 軍,李佳宇,高安亮

(成都醫學院第二附屬醫院核工業四一六醫院神經外科,成都 610051;*通訊作者,E-mail:3034240438@qq.com)

癲癇(epilepsy,EP)是一種臨床常見神經系統綜合征,大腦皮層神經元神經過度興奮以及神經元突發性生物電信號導致癲癇發作,持續發作時可導致腦水腫,短暫性損傷大腦功能,并引發患者焦慮、抑郁等心理疾病,其病情進展緩慢,但可反復發作、難以治愈,嚴重威脅患者身心健康,給其家庭和社會造成沉重負擔[1,2]。腦室內出血、腦卒中、缺氧缺血等是EP的主要致病因素[3],酪氨酸激酶Src可通過調控小膠質細胞磷酸酶、張力素同源蛋白的表達及核因子NF-κB的轉錄活性、核轉運參與介導神經元的發生發展[4,5],抑制Src磷酸化激活可改善癲癇模型大鼠臨床癥狀,減輕腦水腫。研究發現,抑制ERK1/2磷酸化可減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠脊髓炎癥及體內外神經炎癥,降低腦缺血再灌注大鼠腦水腫程度,改善神經功能[6-8];EP患者肺組織P38蛋白的磷酸化水平升高,導致神經源性肺水腫[9],這些發現提示ERK1/2和P38信號可能與癲癇誘導的腦水腫有關,但Src激酶抑制劑PP2是否可影響癲癇持續狀態性大鼠腦水腫形成及ERK1/2和P38信號通路,目前并不清楚,本文通過建立癲癇大鼠模型,對此進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性SD大鼠購自上海斯萊克實驗動物有限公司,許可證號:SC-XK(滬)20082-005,質量合格證號:2015000504404,SPF級,體質量200-240 g。飼養條件:大鼠自由飲食、飲水,溫度25 ℃,明12 h/暗12 h,相對濕度50%,環境整潔、安靜且通風良好。

1.2 材料與儀器

Src激酶抑制劑PP2(貨號為LM234),上海聯邁生物工程有限公司;丙戊酸鈉口服溶液(國藥準字H20041435),賽諾菲(杭州)制藥有限公司;戊四氮(貨號為P6500),上海赫果生物科技有限公司;氯化鋰(貨號為S24112),上海源葉生物科技有限公司;大鼠TNF-α(ab100785)及IL-6 ELISA試劑盒(ab100772)、兔源ERK1/2(ab17942)、p-ERK1/2(ab223500)、P38(ab170099)、p-P38(ab4822)及GAPDH一抗(ab181602)、羊抗兔二抗(ab150077),美國Abcam公司;RIPA裂解液(P0013K)、BCA試劑盒(P0011)、HE染色試劑盒(C0105),上海碧云天公司。輪轉切片機、包埋機、烤片機(型號分別為RM2035、EG1160、HI1220),德國Leica公司;倒置顯微鏡(型號為1X70),日本Olympus公司;低溫高速離心機(型號:Centrifuge 5424R),德國Eppendorf股份公司;酶標儀(型號:XElx800),Perkin Elmer公司;蛋白電泳儀、半干轉膜儀(型號分別為1659001、Trans-Blot SD),美國Bio-Rad公司;凝膠成像系統(型號為2500),上海天能公司。EEG-4418K型腦電圖儀(NIHON KONDEN公司);立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物模型制備及分組給藥 參照文獻[10]制備EP大鼠模型,SD大鼠腹腔注射127 mg/kg的氯化鋰,間隔24 h后,腹腔注射35 mg/kg的戊四氮,于30 min后觀察大鼠行為,當其出現面肌抽動、肢體陣攣、跌倒等癥狀時,參照Racine分級[11]評定癲癇發作級別,標準如下:Ⅰ級為面部陣攣;Ⅱ級為頸部肌肉痙攣,甩尾或節律性點頭;Ⅲ級為單側前肢抽搐;Ⅳ級為雙前肢抽搐;Ⅴ級為四肢抽搐、跳躍、失去平衡或跌倒等。建模大鼠持續出現Ⅳ級以上癲癇發作表現,表明建模成功,建模63只,成功60只,將其隨機分為模型組、PP2低劑量(1 nmol)組、PP2中劑量(2.5 nmol)組、PP2高劑量(5 nmol)組、丙戊酸鈉組,每組12只,另取12只SD大鼠腹腔注射等劑量無菌生理鹽水,設為對照組。

參照文獻[12],在模型制備成功后,腹腔注射300 mg/kg的10%水合氯醛麻醉大鼠,將其頭部固定在立體定位儀上,顱頂備皮后消毒,切開皮膚,使用3%雙氧水擦拭骨膜使前囟點清晰暴露,于前囟后0.8 mm,矢狀縫右側1.5 mm處用針頭鉆一小孔,鉆透顱骨但不傷及大腦,小心插入一個帶微量進樣針的套管,深度為1 mm,然后縫合皮膚后消毒。將Src激酶抑制劑PP2溶于DMSO中配制為0.2,0.5,1 nmol/μl的溶液,PP2各劑量組大鼠每天均以微量進樣針緩慢注射5 μl,使最終劑量為:PP2低劑量組1 nmol、PP2中劑量組2.5 nmol、PP2高劑量組5 nmol,丙戊酸鈉組大鼠給予5 mg/kg丙戊酸鈉[13]灌胃治療,假手術組及模型組大鼠每天以同樣方法緩慢注射5 μl DMSO,并以等劑量生理鹽水灌胃,持續3 d。期間青霉素抗感染處理。

1.3.2 檢測大鼠癲癇發作情況 用藥結束24 h后,腦電波(electroencephalogram,EEG)采用腦電圖儀記錄,紙速30 mm/s、時間0.1 s、頻率35 Hz、增益10 μV/mm,連續描記5 min。觀察各組大鼠活動情況,記錄其一天之中癲癇發作次數及其持續時間。

1.3.3 檢測大鼠腦水腫情況及標本收集 大鼠癲癇發作情況檢測結束后,尾靜脈取血1.5 ml,靜置后離心收集上清,即可得到血清,將其儲存于-80 ℃備用;將各組大鼠麻醉后處死,解剖取出大腦,各組隨機選取6只大鼠的整個大腦稱重,即為濕重,將其置于烤箱中烤干,稱重即可得干重,計算腦組織含水量即可檢測腦水腫情況,公式為:腦組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。各組剩余6只大鼠的大腦以PBS沖洗干凈后,剪取約0.5 g,剪碎后加入蛋白裂解液,以勻漿機制備為勻漿液,離心收集上清,即可得總蛋白樣品液,剩余組織以PBS漂洗干凈后置于4%多聚甲醛中固定,再以80%,90%,100%濃度的酒精依次脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,最后使用切片機做病理切片備用。

1.3.4 檢測大鼠皮層神經元病理變化 選取1.3.3中病理切片完整且含有皮質區組織,脫蠟后,以100%,90%,80%濃度的酒精依次浸泡后,經蒸餾水漂洗后,以HE試劑盒進行染色,具體參照說明書的步驟進行,經再次脫水、透明后封片,置于顯微鏡下觀察大鼠皮質神經元病理變化,任選5個視野拍照。

1.3.5 測定大鼠腦皮質區ERK1/2和P38通路相關蛋白表達 將1.3.3中凍存的蛋白樣品液置于4 ℃冰箱中凍融,以BCA試劑盒測定其濃度,參照說明書的步驟進行操作,各組取含20 μg總蛋白的樣品液進行電泳,使蛋白分離,然后將其轉移至硝酸纖維膜上,以5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后,根據目的蛋白分子量截取條帶置于小盒中,經兔源ERK1/2、p-ERK1/2、P38、p-P38及GAPDH一抗(稀釋比分別為1 ∶2 000、1 ∶5 000、1 ∶2 000、1 ∶2 500、1 ∶1 000)于4 ℃條件下孵育過夜后,以TBST漂洗3次,加入羊抗兔二抗(稀釋比為1 ∶2 000),置于搖床上,室溫孵育2 h,以TBST再次漂洗3次,采用增強化學發光法顯色,以凝膠成像儀對蛋白條帶進行拍照,然后以Image Lab軟件對圖像進行分析,得出各組蛋白相對表達量。

1.4 數據分析

2 結果

2.1 PP2對大鼠癲癇發作的影響

對照組大鼠皮層區以基礎波α、β波為主,無明顯節律性;模型組大鼠出現散在性癇波,多為尖波、棘波、棘慢復合波,大量癇性放電;PP2低、中、高劑量組、丙戊酸鈉組均可見到散在的尖波、棘波,而以PP2高劑量組出現的最少(見圖1)。與對照組相比,模型組大鼠癲癇發作次數、持續時間升高(P<0.05);與模型組相比,PP2低、中、高劑量組、丙戊酸鈉組大鼠癲癇發作次數、持續時間降低,且PP2三組之間呈劑量依賴性變化(P<0.05),PP2高劑量組與丙戊酸鈉組相比,差異無統計學意義(P>0.05,見表1)。

圖1 各組大鼠腦皮層區EEG情況

表1 各組大鼠發作次數、持續時間

2.2 PP2對大鼠腦水腫的影響

與對照組相比,模型組大鼠腦組織含水量升高(P<0.05);與模型組相比,PP2低、中、高劑量組、丙戊酸鈉組大鼠腦組織含水量降低且在不同PP2組間呈劑量依賴性(P<0.05),而PP2高劑量組與丙戊酸鈉組相比,差異無統計學意義(P>0.05,見圖2)。

與對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與PP2低劑量組相比,cP<0.05;與PP2中劑量組相比,dP<0.05

2.3 PP2對大鼠神經元的影響

對照組大腦皮質神經元細胞形態規則,排列規律,細胞膜及細胞核完整、清晰,數量較多;模型組大鼠大腦皮質神經元細胞形態不規則,變小皺縮,排列紊亂,細胞膜及細胞核不清晰,細胞較多凋亡,數量減少,出現病理損傷;與模型組相比,PP2低、中、高劑量組、丙戊酸鈉組大鼠皮質神經元細胞病理損傷減輕,且隨劑量升高減輕程度呈依賴性增強,PP2高劑量組與丙戊酸鈉組大鼠皮質神經元細胞病理損傷減輕程度相似(見圖3)。

A.對照組;B.模型組;C.PP2低劑量組;D.PP2中劑量組;E.PP2高劑量組;F.丙戊酸鈉組

2.4 PP2對大鼠ERK1/2和P38信號通路的影響

與對照組相比,模型組大鼠腦皮層區p-ERK1/2/ERK1/2、p-P38/P38升高(P<0.05);與模型組相比,PP2低、中、高劑量組和丙戊酸鈉組大鼠腦皮層區p-ERK1/2/ERK1/2、p-P38/P38降低,且在PP2三組之間降低呈劑量依賴性(P<0.05),PP2高劑量組與丙戊酸鈉組相比,差異無統計學意義(P>0.05,見圖4)。

與對照組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05;與PP2低劑量組相比,cP<0.05;與PP2中劑量組相比,dP<0.05

3 討論

EP患者癲癇發作時,咳嗽反射減弱或消失,造成支氣管痙攣,引起呼吸衰竭,進而引起腦組織缺血缺氧,使星形膠質細胞及小膠質細胞活化,破壞血腦屏障,導致腦水腫,嚴重時甚至可危及生命,目前其病死率高達2%,找到安全有效的治療藥物具有重要的社會及臨床意義[14-16]。本文對SD大鼠進行腹腔注射氯化鋰及戊四氮建立EP模型,結果顯示,建模大鼠出現散在性癇波,多為尖波、棘波、棘慢復合波,大量癇性放電,皮質神經元細胞形態不規則,變小皺縮,排列紊亂,細胞膜及細胞核不清晰,細胞較多凋亡,數量減少,出現嚴重病理損傷,癲癇發作次數及持續時間、腦組織含水量增加,表明腹腔注射氯化鋰及戊四氮可使大鼠出現大量癇性放電,同時皮質神經元損傷嚴重,造成腦水腫,模型建立成功。

Src作為一種酪氨酸蛋白激酶,是激活受體并向胞內傳遞信號的核心蛋白激酶,廣泛參與腦組織中神經元的突觸可塑性、神經元的增殖、凋亡等生理過程,在神經炎癥的發生發展中起到重要的調控作用,激活Src可上調巨噬細胞炎性蛋白-1α表達,進而促使神經炎癥發生及進展[17],通過抑制Src磷酸化激活可降低其下游ERK1/2及P38蛋白磷酸化水平來抑制LPS誘導的小膠質細胞活化[18];P38信號參與癲癇大鼠導致心臟損傷病理過程,上調其磷酸化水平可促使Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白表達,加重大鼠心肌細胞疾病發生與發展[19],ERK1/2及P38信號與神經元關系密切,可能參與與腦水腫過程。本研究結果顯示,以Src激酶抑制劑PP2處理模型大鼠,可減輕皮質神經元病理損傷,降低癲癇發作次數及持續時間、腦組織含水量、腦組織p-ERK1/2/ERK1/2、p-P38/P38且PP2三組之間變化呈劑量依賴性,表明PP2可降低EP大鼠腦組織ERK1/2及P38磷酸化水平,可減輕癲癇發作,緩解腦水腫,保護神經功能,改善其臨床癥狀,揭示抑制ERK1/2和P38信號激活可能是Src激酶抑制劑PP2緩解癲癇持續狀態性大鼠腦水腫的作用機制。

綜上所述,Src激酶抑制劑PP2可能是通過抑制ERK1/2和P38信號磷酸化激活緩解腦水腫進而緩解癲癇,改善EP大鼠臨床癥狀,但本文未使用ERK1/2、P38信號通路激動劑及抑制劑進行對照驗證,關于其藥理機制的證據并不充分,還需后續的深入研究。