微滴式數字聚合酶鏈反應檢測金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌

母潤紅,聶丹丹,趙 明,馬 麗

(1.北華大學基礎醫學院,吉林 吉林 132013；2.長春海關技術中心，吉林 長春 130000)

WHO將非洲豬瘟列為動物疫病[1]。我國是養豬大國，建立靈敏、準確的診斷方法尤為重要。金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌污染飼料和水源是導致病原傳播的重要因素[1-2]。家禽家畜一旦感染此種致病菌可引起相應的傳染病，并在畜禽中廣泛傳播，發病率和傳染性均較強[2]。因此，迫切需要開發一種快速定量檢測病原體的技術。而微滴式數字聚合酶鏈式反應(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)檢測技術是全新的技術手段[3-4]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

標準菌株15株，購自美國典型培養物保藏中心(金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌、豬霍亂沙門氏菌、李斯特菌、普通變形桿菌、小腸耶爾森菌、大腸桿菌、克雷伯氏菌、糞腸球菌、沙門氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血弧菌、陰溝腸桿菌)和長春海關技術中心保存菌株中心(霍亂弧菌、志賀氏菌)。

2×dd PCR預混液和PCR耗材購自Bio-Rad公司；微滴分析讀取儀(美國Bio-Rad)。

1.2 樣本制備

針對市場上常見的雞、鴨、豬、羊等牲畜類飼料等10種產品進行本底實驗，每種平行3次。

1.3 增菌培養

采用均質器將樣品配制進行拍打制成1∶10的樣品溶液。金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌按照GB/T 23743方法進行；陰性菌株增菌。

1.4 DNA的提取

取上述培養的增菌液各1 mL均加到1.5 mL無菌離心管中，按照常規CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取模板DNA。

1.5 PCR擴增

金黃色葡萄球菌的nuc特異性基因序列、蠟樣芽孢桿菌的16 s保守基因序列對飼料中金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌進行鑒定。參考文獻，引物的序列見表1。將得到如下的反應體系和擴增參數:模板DNA 5 μL,上、下游引物各4 μL,探針1 μL，2×dd PCR預混液10 μL，總體積20 μL(見表2,其中空白對照實驗時用雙蒸水替代樣品DNA,陰性對照實驗時用非目標源性成分替代樣品DNA,陽性對照實驗時用金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌陽性成分DNA)。

內標擴增參數:模板DNA 5 μL,上、下游引物及探針各1 μL,去離子水2 μL，2×dd PCR預混液10 μL，總體積20 μL(見表2)，退火溫度60℃。

表 1 引物探針序列

表 2 雙重PCR反應體系

1.6 實時熒光定量PCR(qPCR)反應條件的建立

總體系20 μL，按引物濃度(0.5～1.0 μmol/L)、探針濃度(0.1～0.5 μmol/L)、退火溫度(55～60 ℃)條件優化實驗。通過比較Ct域值、熒光信號強度和熔解曲線擴增效率來判定優化結果，并設陰性對照。

1.7 ddPCR反應條件的建立

與qPCR反應相同的引物和探針進行ddPCR 反應，2×Supermix for probes (without dUTP) 12.5 μL，上、下游引物終濃度為10 μmol/L，探針終濃度為10 μmol/L，模板5 μL，ddH2O補足20 μL?？傮w積20 μL。將反應液加入微滴生成卡一排，70 μL微滴生成油加入最后一排，蓋上膠墊，置入微滴生成儀，微滴反應自動生成。反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s，60 ℃ 1 min，40個循環；98 ℃ 10 min。擴增結束后，將96孔板置入微滴讀取儀中進行信號讀取，并使用軟件Quanta soft V1.3.2.0分析實驗數據，獲得檢測結果并分析。

1.8 ddPCR特異性和重復性實驗

以DNA濃度1×108～1×103copies/μL的10倍系列梯度稀釋為模板進行ddPCR反應，每個梯度濃度設立重復3孔，同樣的反應條件重復6次，通過RSD判斷該方法的重復性和穩定性。

1.9 ddPCR敏感性實驗

取濃度為1×108copies/μL純菌液10倍濃度依次稀釋，進行檢測，設置每個梯度濃度重復3次。

1.10 ddPCR本底實驗

采用10種常見飼料產品進行本底實驗，每種平行3次。

2 結 果

2.1 特異性實驗

ddPCR對提取和制備的金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌及15株其他病原菌DNA作模板，評價建立ddPCR方法特異性。結果顯示，金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌均呈現陽性擴增信號，每孔微滴生成量均衡(圖1,藍色是金葡菌，綠色是蠟樣);而15株其他病原菌實驗孔均未檢出到陽性微滴信號，均不存在交叉反應，表明建立的金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌ddPCR方法特異性較強。

2.2 ddPCR擴增的重復性實驗

以5個濃度梯度的金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌DNA為模板設立重復性實驗，每個濃度設置3個重復孔，重復6次，測定組內和組間相對標準差。結果顯示，金黃色葡萄菌數據結果平均值為88 copies/μL,SD為6.8,RSD為6.37%(圖2a);蠟樣芽孢桿菌數據結果平均值為233 copies/μL,SD為19.7,RSD為2.03%(圖2b)。表明ddPCR對其擴增穩定，實驗數據可信。

圖 1 金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌特異性檢測

圖 2 金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌ddPCR重復性實驗

2.3 ddPCR擴增的靈敏度實驗

測定金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌DNA濃度，將系列10倍梯度稀釋(108～103copies/μL)，測定ddPCR靈敏度。結果顯示，建立的ddPCR方法的最低檢測極限大約為1×104拷貝(圖3)。表明ddPCR檢測方法靈敏度較高。

圖 3 金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌雙重靈敏性實驗

2.4 ddPCR本底實驗

本實驗采用10種常見飼料產品進行本底實驗，每種平行3次，進行本底實驗，經實驗驗證均未檢出金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌。

3 討 論

高營養飼料在消毒不當等情況下，易生長有害菌，可使飼料產生毒素，危害畜牧生產。金黃色葡萄球菌多為致病性病原菌，致病力較強；芽孢桿菌屬中的蠟樣芽孢桿菌極易引起食物中毒。目前qPCR法是食源性病原體檢測的主要方法，此方法依賴Ct值和制作標準曲線，同時樣品中抑制劑都會影響檢測的準確性,結果極易出現假陰性[5]。ddPCR檢測手段排除了qPCR法的弊端和不足，該方法無需制作標準曲線，痕量水平檢測[5-7]。建立雙重ddPCR方法對飼料中金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的檢測是基于qPCR技術基礎上發展而來的，而且靈敏度更高[8]。

本研究將qPCR法優化反應系統中引物和探針濃度應用于ddPCR法可以擴增出目標靶點，發現引物濃度過高和過低擴增條帶均不能明顯區別出來,探針濃度也影響ddPCR法微滴的離散分布，所以最佳的引物濃度和探針濃度配比優化是ddPCR檢測結果高效性的主要因素。本實驗顯示，ddPCR法檢測穩定性良好，具有較高的檢測靈敏度。將建立的檢測方法運用到10種常見飼料產品進行本底實驗中，均未檢出金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌。建立飼料中金黃色葡萄球菌和蠟樣芽孢桿菌的雙重ddPCR檢測方法，對于保障養殖業發展、保護我國飼料產品安全和經濟利益具有十分重要的意義。