何嘉宇,高 銳,陳振宇,譚振宇,覃 銳,郗艷麗*
(吉林醫藥學院:a.公共衛生學院;b.臨床醫學院,吉林 吉林 132013)
熊果酸主要分布于女貞子、夏枯草、車前子、山楂、大棗和苦丁茶等植物中[1-2]。熊果酸能改善動脈粥樣硬化大鼠的炎性反應和氧化應激[3],緩解香煙引起的大鼠肺氣腫[4],治療糖尿病小鼠的心肌病變[5],抑制CCl4所致的小鼠肝組織出現損傷[6]。此外,熊果酸還能通過促進糖原合成酶激酶發生磷酸化而引起肝癌細胞HepG2發生凋亡[7]。熊果酸能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路誘發胃癌細胞MGC-803發生自噬[8]。沙棘中的熊果酸能對H22荷瘤小鼠的移植瘤起到抑制作用[9]。研究還發現,熊果酸能顯著抑制人肺癌細胞PC9的增殖,并誘導其發生自噬[10]。表明熊果酸除了治療作用以外,還具有一定的毒性作用。但關于熊果酸的體內毒性研究較少。本研究以連續28 d染毒的方法觀察熊果酸對ICR小鼠的毒性作用。
熊果酸(上海麥克林生化科技有限公司);尿素氮(urea,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、膽固醇(cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)(南京建成生物工程研究所);安穩血糖試條(三諾生物傳感股份有限公司)。
Epoch多功能酶標儀(美國BioTek);NIU科研級正置熒光顯微成像系(美國Nikon);QUINITIX124-1CN電子天平(美國 塞多利斯);石蠟切片機和組織包埋機(德國Leica)。
ICR小鼠,清潔級,18~22 g,雌雄各半,購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司,動物合格證號:SCXK(吉)-2018-0007。飼養于吉林醫藥學院實驗動物中心?;A飼料喂養,飼料購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司,許可證號:SCXK(吉)-2015-0005。飼養條件:溫度18~22℃,濕度45~65 ℃,12 h明暗交替。所有實驗均按照美國國立衛生研究院《實驗動物護理與使用指南》和《動物毒理學使用原則》進行,并經吉林醫藥學院醫學倫理委員會批準(許可證號:2018LW011)。
ICR小鼠50只,隨機分為5組,即空白對照組,溶劑對照組和熊果酸低、中、高劑量組(5、10和15 mg/kg),每組10只。除空白對照組和溶劑對照組,各組均給予熊果酸混懸溶液(熊果酸溶于0.5%羧甲基纖維素鈉溶液中,現用現配,超聲混勻)灌胃,連續28 d,1次/d,空白對照組給予相同體積的生理鹽水灌胃,溶劑對照組給予相同體積的0.5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃。
一般情況觀察:實驗期間,每天觀察并記錄動物的一般表現、行為、中毒表現和死亡情況。
臟/體比:末次給藥后禁食不禁水24 h,稱量小鼠體重后眼球取血處死,并對所有動物進行大體肉眼觀察,處死動物后打開腹腔觀察內臟形態,剝離臟器組織并用生理鹽水洗凈,濾紙蘸干后稱重,計算臟/體比值。
血液學指標檢測:給予受試物28 d后,小鼠禁食不禁水24 h,眼球取血處死小鼠,留取血液測定血紅蛋白、紅細胞計數、白細胞計數及分類。
血清中BUN、Cr、TC、TG、ALT和AST和血糖的含量測定:留取血液,血糖儀測定血糖。剩余血液,3000 r/min離心10 min,取上清,按照試劑盒說明書檢測各組血清中BUN、Cr、TC、TG、ALT和AST的含量。
病理組織學觀察:將組織于4%多聚甲醛固定24 h,常規石蠟包埋,切皮備用,用于HE染色,光學顯微鏡下觀察,并拍照。
數據采用SPSS16.0統計軟件進行分析,結果用均數±標準差表示,各組間均數比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用最小顯著差法檢驗,兩組間比較用t檢驗,檢驗水準α=0.05。
各組小鼠的生長發育、活動均正常,未發現中毒現象和死亡情況。
結果顯示:與對照組比較,受試樣品各劑量組小鼠初始體重、雌鼠每周進食量差異無統計學意義(P>0.05)。與第1周比較,雄鼠第2周的進食量顯著增高,但第3周升高不顯著。隨著給藥時間的延長,各組雄性小鼠的飲水量逐漸升高,但差異無統計學意義(P>0.05)。與第1周比較,第2周和第3周低劑量雌性小鼠飲水量顯著升高,但中和高劑量組雌性小鼠飲水量顯著低于低劑量組(P<0.05)。見圖1。各組小鼠終末體重顯著低于初始體重(P<0.05),總體重增加量呈現負數,總體動物體重呈現下降的趨勢,這可能與灌胃的給藥方式有關。通過灌胃造成動物出現飽腹感,食物的攝入量減少,動物體重出現下降。此外,各劑量組的小鼠體重下降也比較明顯,熊果酸的給藥劑量越多,各劑量組小鼠的體重下降越明顯。見表1。
與空白對照組比較,*:P<0.05;與溶劑對照組比較,#:P<0.05;與第1周比較,&:P<0.05
表 1 各組小鼠體重增加量
打開腹腔觀察內臟形態未見明顯改變,各組小鼠肝臟、腎臟、心臟、脾臟和肺臟臟/體比值比較差異無統計學意義(P>0.05)。中劑量組雌性小鼠心臟絕對重量高于空白對照組、溶劑對照組、低和高劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。高劑量組雄性小鼠心臟絕對重量高于空白對照組、溶劑對照組、低劑量和中劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。雌性小鼠中劑量組脾臟絕對重量顯著低于溶劑對照組(P<0.05)。雄性小鼠低劑量組脾臟絕對重量顯著高于空白對照組和溶劑對照組,中和高劑量組脾臟的絕對重量顯著低于低劑量組,低、中和高劑量組肺臟絕對重量顯著低于溶劑對照組(P<0.05)。各劑量組小鼠肝臟和腎臟絕對重量比較差異無統計學意義(P>0.05)。
溶劑對照組各組小鼠血常規指標與空白對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。熊果酸低、中和高劑量組小鼠血常規指標與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。
結果顯示:各劑量組小鼠血清中的BUN、Cr、TG、TC、AST和血糖水平與對照組比較,差異無統計學意義(P>0.05)。各劑量組雌性小鼠血清中ALT水平顯著低于對照組(P<0.05),且隨著給藥劑量的增加,ALT的水平逐漸降低。熊果酸中和高劑量組雄性小鼠血清中ALT水平低于對照組和低劑量組,差異有統計學意義(P<0.05)。結果見表2。
表 2 各組小鼠血清中BUN,Cr,TG,TC,ALT,AST和血糖的含量
各劑量組與對照組比較,肝臟、腎臟、脾臟、心臟、胃、十二指腸組織未見有意義的病理改變。
熊果酸是苦丁茶、酸棗、女貞子等植物中的化學物質,具有較高的生物活性及潛在藥用價值。但對熊果酸的毒理學評價資料較少,根據前期熊果酸急性毒性實驗和預實驗結果,設計本次毒性實驗。
對小鼠體重、進食量和飲水量的結果觀察顯示,各組動物生長發育、活動均正常,未出現中毒和死亡。隨著染毒周期的延長,雌性小鼠的飲水量和攝食量變化均不顯著;雄性小鼠飲水量變化不顯著,但進食量顯著升高。各劑量組小鼠終末體重顯著低于初始體重,雌性小鼠總體重增加量顯著低于空白對照組,雄性小鼠總體重增加量與空白對照組比較差異無統計學意義。這提示小鼠體重下降可能與熊果酸有減肥的作用有關,該作用對雌鼠的作用比較顯著,且這種減輕體重作用與劑量呈現依賴關系。
各劑量組小鼠臟/體比值結果顯示,各組小鼠臟/體比值差異比較無統計學意義。各劑量組小鼠心臟的絕對重量與空白對照組比較有顯著差異,脾臟的絕對重量與溶劑對照組比較差異有顯著性,但這種差異變化沒有顯著的劑量-反應關系,故不認為是損傷效應。熊果酸對受檢臟器組織病理方面無明顯損害。
熊果酸各劑量組小鼠血清中ALT水平隨給藥劑量的增加而逐漸降低,且比較差異有統計學意義,AST的水平也隨著熊果酸給藥劑量的增加而逐漸降低,但比較差異無統計學意義。血清中ALT和AST水平的變化呈劑量-反應關系,這提示熊果酸對肝臟組織有一定的保護作用。適當攝入富含熊果酸的食物有益于改善肝臟功能。血清生化指標中BUN、Cr、TG和TC的變化不顯著。各組小鼠血常規指標比較差異不顯著,表明熊果酸未誘發炎性反應或凝血障礙。
綜上所述,熊果酸具有較好的減肥作用,且有益于肝臟的健康。熊果酸在(5~15)mg/(kg·bw)劑量范圍內以經口灌胃的方式攝入,未對ICR小鼠造成明顯的毒性效應。此結果能為熊果酸亞慢性毒性提供毒理學基礎資料,為熊果酸作為中藥制劑的研發提供實驗依據。