水稻抗蟲(Cry1C)和抗稻瘟病(Pi1, Pi2)材料的創制

柳絮，張華，宣寧，李平波，張夢琦，姚方印

(山東省農業科學院生物技術研究中心，山東 濟南 250100)

水稻(OryzasativaL.)是重要的糧食作物，為全球近一半人口的主食，因此水稻的穩產、高產對保障世界糧食安全具有重要意義。病蟲害是危害糧食安全的主要因素之一，水稻生產周期的某一個階段如果受到病蟲害的侵襲，其產量和品質將會受到極大的影響。

稻瘟病是水稻的主要病害，由病原菌Magnaportheoryzae引起。研究表明，全球每年由于稻瘟病造成的水稻減產量可以滿足6 000萬人口的糧食需求，導致的直接經濟損失高達50億美元[1，2]。稻瘟病在水稻秧苗期至抽穗期均可發生。苗期或分蘗期發病嚴重時，可導致植株死亡；穗期發病會導致白穗或半飽和穗，產量大幅度降低，嚴重時可造成水稻絕收。稻瘟病病原菌的生理小種多樣，并且變異復雜。因此，應用單一的抗性水稻品種難以解決水稻持久抗稻瘟病的問題。近年來，隨著分子生物學的發展，越來越多的稻瘟病抗性基因被定位。本試驗選用的供體親本空育131帶有廣譜稻瘟病抗性基因Pi1和Pi2。

鱗翅目害蟲一直是水稻上最大的威脅之一，由于水稻本身尚未發現有效的抗蟲基因，傳統育種面臨很多困難。目前，Bt毒蛋白基因是使用最廣泛的抗蟲基因，用轉基因的方法將Bt蛋白基因導入常規水稻，可提高水稻對螟蟲的抗性[3，4]。利用水稻抗稻瘟病基因優質資源，培育具有持久抗性的水稻品種，同樣是防治稻瘟病最經濟有效且對環境最安全的方法[1，5]。本實驗室利用以秈稻明恢63為遺傳背景的抗蟲轉基因株系T1C-19與黃淮稻區圣稻15進行雜交和多代回交，已經育成了帶有抗蟲基因Cry1C，且農藝性狀優良的轉基因抗蟲水稻新品系濟抗10號[6]。

目前，黃淮稻區生產上應用的大部分水稻品種抗病蟲能力不強，易遭受病蟲為害，導致產量和品質不穩定[7，8]。為防治病蟲害而大量使用農藥則存在高成本、高毒性、高殘留等問題，易造成環境污染，為食品安全帶來隱患。因此，對水稻品種的抗病蟲性進行改良，聚合不同的抗性基因，通過培育抗性品種防治病蟲害更加經濟、高效與環保。本試驗利用濟抗10號為受體親本，選擇帶有廣譜高抗稻瘟病基因(Pi1，Pi2)的空育131為供體，進行雜交與多代回交，通過分子標記輔助選擇，結合田間農藝性狀篩選，育成了抗蟲和高抗稻瘟病以及適合黃淮稻區種植的4個優良水稻新品系，為黃淮稻區抗病蟲水稻育種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 親本材料

濟抗10號為本實驗室利用以秈稻明恢63為遺傳背景的抗蟲轉基因株系T1C-19與黃淮稻區圣稻15進行雜交和多代回交選育而成，帶有抗蟲基因Cry1C；帶有廣譜高抗稻瘟病基因(Pi1，Pi2)的空育131由黑龍江大學李榮田教授提供。利用濟抗10號為受體親本，空育131為稻瘟病抗性基因的供體親本進行雜交與回交。

1.2 雜交與回交轉育過程

于8月中下旬選取正處于開花期的水稻，以濟抗10號為母本，46℃溫水去雄，以空育131為父本進行雜交獲得F1代，再以濟抗10號為輪回親本，連續回交獲得BC1F1、BC2F1、BC3F1等世代以及自交后代BC3F2。在開花前對每一個雜交或回交后代單株均進行Basta(有效成分PPT)抗性選擇，PPT濃度為1 g/L[9]，PCR跟蹤稻瘟病抗性基因，并結合田間農藝性狀，從中選擇抗蟲且高抗稻瘟病植株再與輪回親本連續回交，或自交純和。

1.3 田間Basta抗性選擇

待水稻植株長至20 cm左右時，用棉簽浸蘸除草劑Basta后涂抹在葉片正反面，3～5 d后統計抗性植株及敏感株數。涂抹處葉片顏色無變化的為抗性植株，葉片顏色變黃的為敏感植株。

1.4 抗稻瘟病基因功能標記檢測

選取Basta檢測陽性的植株，摘取幼嫩葉片，充分研磨，利用TPS法[10]提取DNA，備用。所篩選的與稻瘟病抗性基因Pi1、Pi2緊密連鎖的多態性分子標記分別為RM224和P131[11，12]，PCR反應總體積為20 μL，反應體系為：94℃ 5 min； 94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35個循環[13]；72℃ 5 min。PCR產物經6%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，銀染，保鮮膜包膠保存并記錄結果。

1.5 稻瘟病自然誘發抗性鑒定

自然誘發病圃設在濟南飲馬泉實驗農場，病圃全生育期不噴灑殺菌劑，共進行2次病情調查，分別為移栽前的苗葉瘟調查和黃熟期的穗頸瘟調查。苗葉瘟調查時在每個株系的發病中心選擇有代表性的病叢，以發病最重的20～50張葉片平均發病等級作為該株系的抗性級別；穗頸瘟調查時每小區至少100穗。田間的栽培管理、調查方法、病級劃分、記載標準和抗性評價按照顏群等[14]的水稻品種試驗抗性鑒定方法與標準執行。稻瘟病綜合指數=苗葉瘟病級×25%+穗頸瘟發病率病級×25%+穗頸瘟損失率病級×50%。

1.6 田間抗蟲鑒定

在不用任何藥劑防治的情況下，于每年稻縱卷葉螟高發期田間調查其危害情況及其引起的白穗發生情況，并統計白穗率。

1.7 雙抗材料的田間種植及農藝性狀考察

在濟南飲馬泉試驗農場種植高抗稻瘟病的轉基因抗蟲水稻材料，小區面積為66.7 m2，重復2次，同時種植濟抗10號為對照。田間管理同大田，但不施用任何防病蟲農藥?？疾斓霓r藝性狀有抽穗期、株高、穗長、穗粒數、千粒重和產量等。

2 結果與分析

2.1 轉育經過

2016年配置雜交組合濟抗10號(Cry1C)×空育131(Pi1，Pi2)；2017年以濟抗10號為輪回親本進行回交，獲得BC1F1和BC2F1；2018年獲得BC3F1；2019年自交獲得BC3F2。

2.2 Basta抗性鑒定

2017年共檢測雜交后代單株158株，其中Basta抗性植株107株，敏感植株51株，然后選取Basta抗性植株進行稻瘟病抗性分子標記輔助選擇。選出的15個材料與輪回親本濟抗10號回交獲得的BC1F1代種子同年在海南南繁實驗基地進行加代選育獲得BC2F1，收獲的材料于2018年在濟南實驗基地種植后繼續進行Basta抗性鑒定，2018年共檢測回交后代單株255株，其中Basta抗性單株236株，選取抗性單株繼續進行稻瘟病抗性分子標記輔助選擇并進行田間農藝性狀篩選。2018年選出的16個材料分別與輪回親本濟抗10號繼續回交獲得BC3F1，在水稻成熟期，通過農藝性狀篩選和田間的稻瘟病抗性鑒定，篩選出了4個材料SK01、SK02、SK03、SK04，在2019年自交純和獲得BC3F2。

2.3 分離世代單株稻瘟病抗性基因功能標記檢測

對每一世代單株均分別進行稻瘟病抗性基因(Pi1，Pi2)的功能標記檢測，選取與空育131(Pi1，Pi2)基因型相同的陽性單株繼續與輪回親本濟抗10號進行回交，部分功能標記檢測結果如圖1、圖2所示。

P1: 空育131(Pi1); P2: 濟抗10號; 1～48: BC2F1代單株; 2, 3, 4, 26, 30, 33, 34, 35, 36, 42: 帶有Pi1基因的純和單株; 5, 7, 9, 11, 13, 18, 19, 21, 22, 24, 25, 27, 29, 37, 38, 39, 40, 41, 43, 44: 帶有Pi1基因的雜合單株。

P1: 空育131(Pi2); P2: 濟抗10號; 1～20: BC2F1代單株; 1, 3, 4, 6, 8, 9, 10, 11, 13, 17, 18, 20: 帶有Pi2基因的雜合單株。

2.4 田間稻瘟病抗性鑒定

經過雜交和回交轉育， 2019年6—9月對已自交純和的4個材料SK01、SK02、SK03、SK04進行苗葉瘟抗性鑒定和黃熟期穗頸瘟抗性鑒定。與輪回親本濟抗10號相比，改良株系SK02的稻瘟病抗性明顯提高，稻瘟病綜合指數為3.5；輪回親本濟抗10號的稻瘟病綜合指數為6.9級，抗性評價為感病。4個改良株系稻瘟病綜合指數均在4.0以下，為抗病，其中抗性最好的是SK02(表1)。

2.5 親本與雙抗株系的田間抗蟲性鑒定

2019年6—10月對已自交純和的4個材料SK01、SK02、SK03、SK04進行田間抗蟲性鑒定。在稻縱卷葉螟大發生時期，濟抗10號和已自交純和的4個雙抗株系幾乎沒有受到卷葉螟的危害，空育131的卷葉螟危害較為嚴重，白穗率為39.79%，而選育的4個雙抗株系的白穗率相當低，均小于0.20%(表2)。

表1 稻瘟病抗性鑒定結果

表2 親本與雙抗株系稻縱卷葉螟危害情況

2.6 田間農藝性狀評價

回交轉育的目的是為了將抗蟲基因與抗稻瘟病基因聚合，創制出抗蟲(Cry1C)和抗稻瘟病(Pi1，Pi2)的水稻新材料，所以在對抗性進行選育的同時，更注重了對產量、品質等綜合性狀的選育。由表3可知，SK01、SK02、SK03、SK04不僅表現出很好的抗蟲、抗稻瘟病特性，而且表現出明顯

表3 親本及雙抗株系主要農藝性狀

的豐產性狀；米質與已育成的適宜于黃淮稻區種植的輪回親本濟抗10號相當。

3 討論與結論

目前，有不少水稻抗病和抗蟲基因已被定位和克隆，且有一部分基因被廣泛應用于抗性育種中[15，16]，抗病蟲的水稻品種培育也取得了一定進展。通過分子標記輔助選擇技術進行基因聚合，將不同的抗病蟲基因進行組合將會為新育成的水稻品種提供更加穩定和持久的抗性[17,18]。利用分子標記輔助選擇技術聚合水稻抗性基因已有很多先例，一些水稻新品系已成功選育，且部分品種(組合)已通過審定。倪大虎等[19]利用分子標記輔助育種將Xa23和Pi9基因聚合在一起，聚合系既抗白葉枯病又抗稻瘟病，抗性和抗譜均與親本相當。Liu等[20]利用分子標記輔助選擇技術將2個褐飛虱基因Bph3和Bph27(t)導入易感品種Ningjing3中，得到的聚合系很大程度上提高了對褐飛虱的抗性，避免了由于褐飛虱影響而造成的產量損失。

雖然本實驗室已成功選育出了適合于黃淮稻區種植的抗蟲品種，但是稻瘟病仍是黃淮稻區的主要病害，每年都對水稻的產量和品質造成嚴重影響。在眾多的防治措施中，最為經濟、安全、環保和有效的控制稻瘟病方法是通過發掘、鑒定和利用廣譜持久抗性基因，培育并推廣抗病新品種，提高栽培品種的稻瘟病抗性水平，延長品種的抗病周期。因此，本研究將分子標記輔助選擇技術與傳統育種方法相結合，采用雜交、回交等方法將稻瘟病抗性基因轉入到本實驗室已育成的適宜于黃淮稻區種植的轉基因新品系濟抗10號(Cry1C)中，育成了抗蟲和高抗稻瘟病的優良水稻新品系4個，為充分利用稻瘟病抗性基因和抗蟲基因進行聚合獲得雙抗的水稻材料提供了廣闊的前景。