基于ITS序列的帶葉兜蘭根內真菌群落組成分析

王曉國，張自斌，李秀玲，周主貴*

(1.廣西壯族自治區農業科學院 微生物研究所，廣西 南寧 530007; 2.廣西壯族自治區農業科學院 花卉研究所，廣西 南寧530007)

兜蘭屬是蘭科植物中最具特色的一個類群，分布于東南亞、南洋群島以及太平洋西南大洋洲島嶼國家[1]。近年來，野生兜蘭的過度采集和其自然生境受到嚴重破壞[2]，兜蘭分布區和種群數量劇減[3]。目前，兜蘭全屬植物已被列入“野生動植物瀕危物種國際貿易公約”(CITES)附錄Ⅰ而受到嚴格保護[4]。中國是兜蘭的主要分布區之一，主要分布于西南地區及華南部分地區[5，6]。廣西西北部為我國野生帶葉兜蘭(Paphiopedilumhirsutissimum)的主要分布區域，近年來廣西野生帶葉兜蘭分布破碎化現象加劇，種群恢復的工作刻不容緩[7]。

根內真菌主要定殖于植物根內，大致分為共生、腐生和寄生真菌3種類型。其中，共生真菌可從土壤中直接吸收植物所需礦質營養，協助根系吸收水分，改善植物養分和水分狀況[8，9]。在自然界中，幾乎所有的蘭科植物均具有菌根，其生活始終必須部分或者全部依靠菌根提供養分，共生真菌對蘭科植物的繁殖、生長起著重要的作用[10，11]。在野外環境下，大多數蘭科植物種子必須與合適的共生真菌建立共生關系才能夠萌發，共生真菌對蘭科植物的種群恢復起著重要的作用。

根內真菌的群落結構不僅會影響到共生真菌而且也會對植物的生長和發育起到重要的作用。帶葉兜蘭多見于地生或者石上浮生，為半附生種類，對共生真菌依賴性較強[12]。采用傳統分離培養技術評估植物根內真菌群落多樣性是有限的，并非所有根內真菌都能夠分離培養[13,14]。采用現代分子生物學技術從植物組織中提取總DNA，設計特異引物通過 PCR擴增和基因組分析，可以避免純培養分析根內真菌的局限性[15]，但這些技術仍然不能全面分析根內所有真菌的物種多樣性。高通測量序(high-throughput sequencing)具有測序速度快、通量高的優點，已成為微生物種群結構及多樣性分析的有效先進研究手段[16，17]。為此，本研究本著最小化損傷野生帶葉兜蘭的原則，收集野生帶葉兜蘭根段，利用Illumina Miseq測序平臺對其根內真菌rDNA ITS基因可變區進行測序，結合生物信息學分析野生帶葉兜蘭根內真菌的群落組成，以期為研究帶葉兜蘭根內真菌和內生真菌的關系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

野生帶葉兜蘭根樣于2017年9月采自廣西樂業雅長國家自然保護區內的蘭園(LY)、黃瓊洞(HJD)、邕木(YM)3個樣點。帶葉兜蘭是瀕危蘭科植物，因此本研究選取了根系比較發達的植株，每個植株收集1條約5 cm長的根段。每個樣點分3個采集處，每處收集4～6條根段混為一個樣品處理。根樣收集后，裝于自封袋，適量填充原生境苔蘚或腐殖質，帶回實驗室置于-80 ℃冰箱短期保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 根系總DNA的提取 將根系剪成2～3 cm長的小段，先用自來水沖洗干凈，再用蒸餾水清洗，放入0.1%的升汞中浸泡5 min 左右；取出后用蒸餾水沖洗干凈，再放入75%酒精中浸泡20 s左右，最后用蒸餾水沖洗干凈，晾干后備用。

對根段表面消毒后，采用植物DNA提取試劑盒對根樣總DNA進行提取，其操作流程按照試劑盒說明書進行。所提DNA的完整性采用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，同時采用Nanodrop紫外分光光度計(Thermo Fisher Scientifific，Wilmington，Delaware，USA)對DNA進行定量分析。

1.2.2 文庫構建及測序 以50～100 ng DNA為模板，PCR擴增真菌ITS rDNA上的 ITS2 可變區，真菌通用引物ITS2F(5′-GTGAATCATCGARTC-3′)為前引物，ITS2R (5′-TCCTCCGCTTATTGAT-3′)為后引物，并為每個樣本添加特異性Barcode序列，其中Ba-F(5′-ACCTGCGGARGGAT-3′)為前引物，Ba-R(5′-GAGATCCRTTGYTRAA-3′)為后引物；對各處理樣本中的真菌ITS1區域進行擴增。使用Agilent 2100 生物分析儀檢測文庫質量，并且通過Qubit和實時定量PCR檢測文庫濃度。

DNA文庫混合后，按Illumina MiSeq(Illumina，San Diego，CA，USA)儀器使用說明書進行2×300/250雙端測序(PE)；圖像分析和堿基識別是通過MiSeq工具中的MiSeq Control Software (MCS)進行的，最后在Illumina basespace云端計算平臺進行初始分類分析。上機測序和分析委托蘇州金唯智生物科技有限公司進行。

1.2.3 數據分析 雙端測序得到的正反向reads首先進行兩兩組裝連接，過濾拼接結果中含有N的序列，保留序列長度大于200 bp的序列。經過質量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于OTU分析。使用VSEARCH(1.9.6)進行序列聚類(序列相似性設為97%)，比對ITS rRNA的參考數據庫是UNITE ITS database (https://unite.ut.ee/)。然后用 RDP classifier (Ribosomal Database Program) 貝葉斯算法對OTU的代表性序列進行物種分類學分析，并在不同物種分類水平下統計每個樣本的群落組成?；贠TU的分析結果，采用對樣本序列進行隨機抽樣的方法，分別計算Shannon、Chao1等α多樣性指數，并作出稀釋曲線。

2 結果與分析

2.1 各樣品內的OTU水平分析

本次實驗利用第二代測序技術對帶葉兜蘭不同樣點根樣品中的真菌群落進行了測序研究，測序區域為ITS區段，測序長度在200～500 bp，樣本最小平均長度352 bp，最大平均長度407 bp。共測得原始序列條數為1260490條，過濾掉低質量的序列并均一化后，得有效序列數952589條，并在99%相似度下將其聚類為用于物種分類的OTUs，統計得到所有樣品在不同OTUs中的豐度信息，共產生1028個OTUs。其中HJD處理中1號樣品的內生真菌所得OTUs數量最高，共測得557個OTUs；LY處理中3號樣品中最少，僅有143個OTUs (表1)。

稀釋曲線可直接反映不同樣本的測序數據量的合理性，并間接反映各個樣本中物種的豐富程度。從圖1中可知，9個樣品稀釋曲線均基本趨于平緩，說明這些樣本基本覆蓋了絕大多數的真菌，其真菌群落具有多樣性，此次所得序列可基本反映真實環境中真菌群落結構。但稀釋曲線仍未達到完全飽和，說明仍有部分真菌種類尚未被發現(圖1)

表1 各樣品測序數據

圖1 各樣品的稀釋曲線

2.2 各樣品中內生真菌群落相關性分析

以各樣本點中分布的OTUs數為計算依據，構建韋恩圖(圖2)。圖中每個圓形代表一個樣本點中的3個樣品的真OTUs總數，中間的共有區域的數字代表所有樣品共有的OTUs數目，圓形上的數字代表該樣品特有的OTUs數目。如圖2所示，帶葉兜蘭菌根中總共包含2096個OTUs，其中，以HJD處理樣品中的OTUs最多，包含1075個OTUs；YM處理樣品中的OTUs次之，包含559個OTUs；LY處理樣品中的OTUs最少，包含462個OTUs。有271個OTUs同時出現在YM和LY處理中，381個OTUs同時出現在HJD和LY處理中，498個OTUs同時出現在YM和HJD處理中。254個OTUs在所有處理中均有出現，占21.16%，說明實驗選取的帶葉兜蘭根樣品中，存在一定的相似內生真菌群落組成。

2.3 各樣品中內生真菌多樣性及群落結構差異分析

采用Alpha多樣性指標中的Coverage指數、Shannon指數和Chao1指數來分析各樣品內生真菌的豐富度和多樣性。結果表明，同一樣本點的不同樣品之間Shannon指數存在一定差異，不同樣本點之間也存在差異，說明帶葉兜蘭菌根真菌的群落分化程度較高。從群落豐度Chao1指數和OTUs數量來看，HJD1>HJD3>HJD2>LY1>YM1>YM2>LY2>YM3>LY3，說明HJD樣點的帶葉兜蘭根部的內生真菌群落分化的程度更高。

圖2 各樣本中內生真菌群落相關性分析

PCA的橫坐標表示第一主成分，百分比則表示第一主成分對樣品差異的貢獻值；縱坐標表示第二主成分，百分比表示第二主成分對樣品差異的貢獻值；圖3中的每個點表示一個樣品，同一個組的樣品使用同一種顏色表示。主成分1(PC1)和主成分2(PC2) 對樣品差異性貢獻率分別達到38.30%和24.21%，合計達到62.51%。由各樣品在主成分中的位置可以看出，LY、YM在一個區域內，且距離極為接近，表明兩者之間差異較??；而HJD與LY、YM則存在明顯差異。HJD的組內樣品分布比較松散，樣品間的間隔較大，說明組內樣品的差異顯著(圖3)。以上結果表明，實驗選取的帶葉兜蘭根樣品中，雖存在相似的內生真菌組成，但各樣本點間仍存在一定差異，且可能與各樣本點的帶葉兜蘭生長環境有關。HJD樣點的帶葉兜蘭多生長在石頭上，根系生長環境的均一性較差，更容易受到周圍環境、水分等多中因素的影響，從而造成真菌對宿主組織或生長環境的選擇偏好性，導致帶葉兜蘭根樣本點間也存在較為明顯的差異。

表2 各樣點的Alpha多樣性

圖3 各樣點間根內真菌群落主成分分析

2.4 各樣品中內生真菌群落結構組成分析

利用RDP classifier對各樣品中OTU依次在門(phylum)、綱(class )、目(order)、科 ( family )、屬(genus)水平信息上進行真菌物種分析，挖掘樣本點間的群落結構組成。結果表明，帶葉兜蘭根內生真菌群落共涉及6個門、21個綱、46個目、96個科、143個屬、217個種及大量未分類種類(表3)。

表3 各樣點的根內真菌群落組成

在門的水平中，共鑒定出21個綱，對其中20個主要綱進行分析發現，優勢菌群包括座囊菌綱(Dothideomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes) 、散囊菌綱(Eurotiomycetes)、傘菌綱(Agaricomycetes)、酵母菌綱(Saccharomycetes)、微球黑粉菌綱(Microbotryomycetes)、銀耳綱(Tremellomycetes)以及一些未知菌目。座囊菌綱(Dothideomycetes)、糞殼菌綱(Sordariomycetes)、散囊菌綱 (Eurotiomycetes)及傘菌綱(Agaricomycetes)為各樣品中的優勢菌群。古菌根菌綱(Archaeorhizomycetes)、圓盤菌綱(Orbiliomycetes) 、節擔菌綱(Wallemiomycetes)在HJD樣品中分布較多(圖4)。此外，帶葉兜蘭根樣中存在著大量未分類菌屬。

圖4 綱水平的帶葉兜蘭菌根真菌群落組成

在綱水平中共鑒定出46個目，含量最高的前30個目中包括了傘菌目(Agaricales) 、革菌目 (Thelephorales) 、多孔菌目(Polyporales) 、煤炱目(Capnodiales) 、假球殼目(Pleosporales)、葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales) 、肉座菌目(Hypocreales)、散囊菌目(Chaetothyriales)、曲霉目 (Eurotiales)等以及一些未知菌綱(圖5)。其中，肉座菌目 (Hypocreales)、散囊菌目(Chaetothyriales)、曲霉目 (Eurotiales)在3個樣點中均有分布，紅菇目(Russulales)在YM樣點中分布較多，葡萄座腔菌目(Botryosphaeriales)、炭角菌目(Xylariales)、古菌根菌目(Archaeorhizomycetales)等在HJD樣點分布較多(圖5)。此外，帶葉兜蘭根樣中還存在著大量未分類菌屬。

圖5 目水平上的帶葉兜蘭菌根真菌群落組成

進一步分析發現，在屬水平上，含量最高的前30個目中包括了木霉屬(Trichoderma)、濕傘屬(Hygrocybe)、青霉屬(Penicillium)、外瓶霉屬(Exophiala)、地星屬(Geastrum)、散囊菌屬(Phaeomoniella)、膠膜菌屬(Tulasnella)、鐮刀菌屬(Fusarium)等以及一些未知菌屬。其中大多數菌屬都在HJD樣點中有分布，裸腹菌屬(Gymnomyces)、散囊菌屬(Phaeomoniella)在YM樣點含量較高(圖6)。

由此可見，不同樣點的帶葉兜蘭根內生真菌群落結構組成相近，但各樣點間菌群含量則存在明顯差異，HJD樣點的菌群含量明顯與LY和YM的不同，LY和YM樣點的菌群含量較為接近。這與上述多樣性分析、差異性分析、主成分分析結果一致。

3 結論與討論

根內微生物組成與植物種類、生長時期、組織類型等密切相關[18，19]。此外，植物生長地理位置、降雨量、日照時間、土壤等環境因素也間接影響內生微生物群落的形成[20，21]。HJD樣點3采集處的群落多樣性差異較大，該樣點的帶葉兜蘭多為石生，可能與土壤環境的差異較大有關。YM和LY樣點采集處的群落多樣性也表現出一定的差異，可能是由于此兩處的帶葉兜蘭生長數量較為密集，生長空間的大小可能對群落多樣性的貢獻更大。HJD樣點與YM、LY樣點相比，不管是群落多樣性還是群落組成都要高，且YM、LY樣點帶葉兜蘭多為成片密集生長，這可能表明在小空間尺度上，帶葉兜蘭的種群密度可能在一定程度上影響了根內真菌的多樣性和群落組成。

圖6 屬水平上的帶葉兜蘭菌根真菌群落組成

帶葉兜蘭根內真菌群落由一些常見真菌以及部分未知菌屬組成。在屬水平上，木霉屬(Trichoderma)、濕傘屬(Hygrocybe)、青霉屬(Penicillium)、外瓶霉屬(Exophiala)、地星屬(Geastrum)、散囊菌屬(Phaeomoniella)、膠膜菌屬(Tulasnella)、鐮刀菌屬(Fusarium)等屬為優勢菌群，這與前人的研究結果[22，23]略有區別，這種區別可能是由生長地域的差異所致[24-26]。與蘭科植物形成菌根的共生真菌多為擔子菌門的蠟殼菌(Sebacinaceae)、角擔菌(Ceratobasidiaceae)、膠膜菌(Tulasnellaceae)、革菌(Thelephoraceae)、銹病菌(Pucciniomycotina)、鐮刀菌(Fusarium)等真菌[6]。通過傳統組織分離培養法鑒定到的帶葉兜蘭共生真菌多為膠膜菌(Tulasnellaceae)、角擔菌科(Ceratobasidiacea)真菌及少數鐮刀菌屬(Fusarium)真菌[7]。本研究中優勢菌群中僅有鐮刀菌和膠膜菌為蘭科共生真菌的菌屬，其余菌屬并未鑒定到，這不代表此次實驗中其余蘭科共生真菌沒有定殖到帶葉兜蘭中。植物總DNA的提取方法、測序的深度和OTU的豐度值及數據過濾等極有可能將一些含量較少的蘭科共生真菌的菌屬剔除。分離培養的方法可以分離到部分根內真菌，同時也會低估真菌的多樣性。而非培養的方法雖然得到不可培養的真菌，但較培養的方法能夠更加全面地了解真菌的多樣性和群落結構。共生真菌不管是在種類還是在含量上只占根內真菌的一小部分，除了一些明確的腐生和致病真菌外，其他大多數真菌的種類和含量還是未知，對這些未知真菌確切的生物學功能并不清楚，它們對維持整個根內真菌的多樣性及共生真菌種類和數量上的功能也需要深入研究。