國產化細胞擴增系統及其配套工藝技術分析

程錦生

（上海東富龍醫療裝備有限公司，上海 201108）

關鍵字：細胞擴增系統；一次性生物反應器；生物制藥；自動化；一次性技術

一次性使用技術（Single-use Technologies），同時也稱作一次性使用系統（Single Use Systems，SUS）或一次性使用設備（Single Use Equipment），是一種工藝設備解決方案，其種類繁多，應用范圍廣[1]。在生物制藥領域，近年來，隨著該技術的不斷發展，已廣泛應用于生物制藥領域，并開始改變該領域的生產方式。

生物工藝中一次性使用系統，同時也稱作藥用一次性使用技術，是一種工藝耗材解決方案，通常由聚合材料組件裝配而成，形成一個系統或單元操作，用于單次或一個階段性生物工藝或制藥生產活動[2]。其具備固定投入小、節省時間、污染風險低、操作靈活等優勢，可以加快藥物的研發及上市速度[3]。隨著生物制品行業的快速發展，一次性使用技術正在逐步完善，并廣泛應用于生物制藥各個生產環節，特別是蛋白、抗體、疫苗及細胞治療產品的生產制備[4]。生物工藝中常見的一次性使用系統主要有一次性混合系統、一次性生物反應器、一次性純化系統及一次性灌裝系統等。

總體來說，我國一次性技術的應用起步較晚，發展迅速，越來越多的制藥企業將一次性技術引入到制藥工藝中，但絕大多數一次性設備系統均為國外品牌，國內一次性技術設備研發生產技術能力薄弱，市場被國外品牌壟斷，嚴重制約我國生物技術的發展。細胞培養/發酵用一次性生物反應器作為生物技術的核心，一直是一次性技術研究的焦點，自1996年一次性生物反應器問世以來，經過20 多年的發展，一次性生物反應器技術逐漸成熟，可以滿足多種不同類型及規模的生產要求[5-6]。但是，縱觀國內市場，一次性生物反應器還是以國外品牌為主，如Thermo、Sartorius 以及GE 等，缺乏具備競爭力的國產化自主品牌。為了打破國外的壟斷，經過長期的研究，開發了國產化一次性生物反應器系統，該系統及配套耗材均由自主研發生產，并配套對應生產工藝技術，可實現國外品牌的完全替代。

1 一次性細胞擴增系統

一次性細胞擴增系統（CES）是自主研發的國產化搖擺式一次性生物反應器，可應用于蛋白、抗體、疫苗及細胞治療產品的種子細胞擴增及生產。根據不同的配置需求，可適用于不同的培養模式，系統設備規格齊全，覆蓋0.1～100 L 培養體積需求，可實現連續逐級放大培養及不同規模的生產要求。系統配備一次性培養袋（CES-BAG）使用，形成全密閉的一次性體系，袋內5 倍以上的培養體積放大，可有效地簡化生產操作并預防污染，一次性培養袋使用后無害化處理，大大簡化后續清潔作業并有效杜絕潛在的污染風險。

一次性細胞擴增系統主要分為自動化控制單元及搖擺器。自動化控制單元包含：主機電腦系統，蠕動泵，氣體供應及壓力檢測模塊，如圖1所示。

圖1 自動化控制單元Fig.1 Automation control unit

搖擺器包含：搖擺運動單元、加熱單元、pH 值/DO 檢測單元、溫度監測單元、過濾器單元保溫箱體、稱重裝置。搖擺運動單元由擺動電機帶動托盤軸承導向進行往復圓周擺動；加熱單元由加熱元件和導熱底板組成，采用接觸加熱的方式進行加熱；pH 值/DO 監測單元由pH 值和DO 變送器及光纖組成，通過光纖連接變送器及一次性培養袋檢測，進行精準測量及控制。溫度監測單元主要由溫度傳感器接收溫度信息用于監測及控制溫度；過濾器單元由過濾器加熱器及支架組成，通過加熱器的溫控加熱實現對尾氣過濾器加熱；保溫箱體由RIM 反應注射聚氨酯工藝制成，提供優良保溫隔熱性能；稱重裝置包含高度調節元件，緩沖元件，稱重元件，有效地解決了細胞擴增搖床工作過程中擺動引起的重量偏差，能夠不受細胞擴增搖床擺動干擾，精確測量細胞擴增搖床加液量。

圖2 搖擺器Fig.2 Rocker unit

以上單元模塊通過組合并結合自動化控制系統軟件組成一次性細胞擴增系統設備，系統通過與一次性培養袋配合使用，組成密閉的一次性細胞培養/發酵工藝平臺，為蛋白、抗體、疫苗及細胞治療產品的種子細胞擴增及生產提供良好的國產化一次性工藝方 案。

2 一次性細胞擴增系統配套應用工藝

細胞培養/發酵工藝是生物制藥的關鍵核心，不同的設備對應不同的工藝技術路線，一套成熟的工藝需要經過一系列的開發及優化過程，可能需要相當長的時間。為了更好地支持生物制藥工藝技術與細胞擴增系統的結合，提供配套的工藝作為基礎技術路線以供參考是非常必要的。針對不同的細胞類型及培養方式，在驗證實驗室條件下開發獲得了對應的工藝參數，本文以HEK 293 無血清懸浮培養為例，進行應用工藝及效果介紹。

2.1 HEK 293 懸浮培養參考參數

對于不同培養體系下最佳參數值，應在使用時調整，需要調整的情況及調整方法主要有：

（1）溶氧水平低：調高轉速及擺動角度，角度調整優先；

（2）細胞聚集成團：調高轉速及擺動角度，角度調整優先；

（3）產生大量氣泡：降低轉速，提高搖擺角度。

2.2 HEK 293 逐級放大培養作業工藝流程

2.2.1 HEK 293 細胞株復蘇及上游細胞搖瓶培養，當細胞量達到CES 細胞擴增系統所需接種量時，即可接種至CES 細胞擴增系統進行逐級放大培養。

注：接種一般建議細胞密度不小于0.6×106/mL，最小接種體積為CES-BAG 最大體積的10%。

2.2.2 選擇適當規格的CES 細胞擴增系統及配套CES-BAG，參考CES 使用說明連接設備管線并安裝CES-BAG。

2.2.3 CES 細胞擴增系統開機，登錄系統控制軟件，設定作業批號，選擇培養模式并充氣，之后進入“校正”界面，進行泵校正及pH 值/DO（輸入CESBAG 參數）確認。

注：系統軟件根據關聯設定自動監控pH 值和DO，pH 調節可關聯CO2或酸/堿，DO 可關聯O2和N2。

2.2.4 使用補料瓶或補料袋通過內置/外置泵將預先配制的新鮮培養基泵入CES-BAG 內，設定培養基平衡過程中的運行參數，培養基介質平衡需2 h 以上。

注：介質平衡過程中pH 值與溫度參數設定要求與培養過程基本相同，pH 值設定7.0/7.1，溫度設定在36.5～37℃之間，搖擺速度、角度及通氣量參考《工藝參數設置參考明細表》中參數。

2.2.5 當介質培養基pH 值及溫度完全平衡后，取樣4～8 mL 檢測pH 值，根據檢測值進入“校正”界面設置偏離值并標定100% a.s DO。

2.2.6 收集上游HEK 293 細胞至轉種瓶，通過設定的補料泵接種至CES-BAG 內的已平衡培養基中，設定培養T：36.5～37℃，pH 值：7.0/7.1，DO：40%，并設定對應的死區及報警上限，搖擺速度、搖晃角度及通氣量，參考表1。

表1 工藝參數設置參考表（數據來自驗證實驗室）Tab.1 Process parameters settings reference list

注：推薦設定值，死區：T 為0.2℃，pH 值為0.2，DO 為2%；報警上下限T 為35.5～37.5℃，pH 值為6.7/7.4，DO 為38%～150%。

2.2.7 點擊“啟動”按鈕開始設備運行，CES 細胞擴增系統根據設定參數及關聯設定自動通過PID 控制，細胞培養過程中取樣監測細胞密度、活率、糖含量及代謝情況，根據需要添加培養基或補料繼續培養。在培養過程中隨著細胞密度擴大及培養體積擴大，轉速、搖晃角度及通氣量需做適當調節，詳參見表1。

2.2.8 當CES-BAG 內細胞培養體積放大到最大，可繼續培養，在細胞處于指數生長期時，收獲轉種至下一級CES細胞擴增系統或大規模生物反應器繼續培養。

2.3 應用實例

CES-100L HEK 293 無血清培養。

2.3.1 培養流程

（1）將培養的種子細胞接種至CES-100L 的100 L CES-BAG（有效培養體積10～50 L）內，初始接種體積10 L，初始接種密度0.6×106/mL。

（2）設定初始培養參數（pH 值/DO 模式）T：37℃、pH 值：7.0、DO：40%、轉速：12 r/min、角度：5°，通氣量1 000 mL/min。

（3）培養過程中，CES-100S 細胞擴增系統自動監控培養過程關鍵參數，作業人員每天通過取樣程序，使用注射器從取樣口取樣檢測，檢測活細胞密度、活性、pH 值、Gluc 并記錄。

（4）根據細胞檢測結果按照0.6×106/mL 補充培養基，擴大培養。

（5）當培養體積擴大到最大培養體積50 L 時，繼續培養，補充葡萄糖，維持糖含量2～6 g/L。

注：測試過程關鍵參數設定詳見表2。

表2 細胞培養參數記錄表Tab.2 Cell expension main parameters daily test record

圖3 CES-100L HEK 293 生長曲線Fig.3 CES-100L HEK 293 cell expension profile

2.3.2 細胞培養效果

結果評價：HEK293 細胞在接種后即開始進入快速增長，HEK293 最高活細胞密度（PVCD）1.234×107/ mL，到達平臺最高密度之前，細胞活性保持在95%以上。細胞培養擴增效果滿足用戶需求，完全可以替代進口設備。

一次性細胞擴增系統系列產品型號有10 L、25 L、50 L、100 L 及200 L，細胞培養體積0.2～100 L，對市面上同類進口設備的培養體積規模實現全覆蓋，滿足上游細胞、規?；糯蠹吧a表達要求，可有力支持我國抗體、蛋白、疫苗及細胞基因行業的研發及規?；a。

3 結束語

一次性細胞擴增系統是自主國產化一次性生物反應器設備系統，為細胞培養/發酵提供一次性工藝解決方案支持，可實現對進口品牌的國產化替代，有助于打破進口品牌對國內市場的壟斷。目前一次性擴增系統已經成功應用于多種生物制藥技術領域，尤其在疫苗及免疫細胞治療領域，未來隨著其在生物制藥領域應用的深入，一次性擴增系統設備及配套技術將逐步優化提升，得到更廣泛的認可，實現對進口品牌的完全替代。