不同終止發酵方法制備低醇菠蘿酒

王琰，曾新安，蔡錦林

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東廣州 510640）（2.中新國際聯合研究院，廣東廣州 510000）

低醇酒是釀制果酒的一種，由于其酒精度低，營養價值高越來越受到消費者的歡迎。最早出現的低醇酒是低醇葡萄酒[1]，GB 15037-2006 中規定低醇葡萄酒是采用鮮葡萄或葡萄汁經全部或部分發酵，采用特種工藝加工而成的酒精度為1%～7%的葡萄酒。低醇菠蘿酒也采用此定義法。菠蘿，味甘、微酸，含有豐富的維生素，有解暑止渴，消食止瀉等功效。成熟菠蘿糖度一般在110～160 g/L[2]，是釀造低醇酒的合適原料。

目前低醇酒的釀造方法一般有脫醇法，特殊酵母發酵法，酶處理法，終止發酵法[3]，其中又以終止發酵法最為常用，一般包括熱處理，降溫，添加二氧化硫等。熱處理一般采用巴氏殺菌法，在75～90 ℃殺滅酵母菌[4]。脈沖電場滅菌技術處理時間短，殺菌效率高且熱效應不明顯，將其應用于果酒的低溫滅菌處理能更好的保存果香和營養成分[5]。酵母菌是單細胞真核微生物，對脈沖處理敏感，一般10 kV/cm 就能致死，且脈沖寬度也對其影響顯著[6]。影響脈沖電場殺菌的因素主要有電場強度、有效處理時間、脈沖波形等，有效處理時間取決于介質接受的脈沖數與脈沖寬度[7]。目前對酵母菌的致死研究主要是果汁[8]和啤酒[9]類，對低醇酒的終止發酵效果研究很少。

本試驗選取熱滅菌、二氧化硫法以及脈沖電場滅菌終止發酵方式制備菠蘿低醇果酒，探討不同終止發酵方式對發酵過程中的酵母致死率以及菠蘿低醇酒酒精度、殘糖、總酸、揮發酸、干浸出物、總二氧化硫、色澤、香氣成分、感官分析的影響，選取一種對菠蘿低醇酒品質影響最小的終止發酵方法，以期為低醇酒的生產提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海南東閣鎮新鮮金菠蘿；ELEGANCE 馬利酵母、Optivin RED 果膠酶、偏重亞硫酸鉀、檸檬酸（食品級）；乙醇為色譜級；酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基；甲基異丁基甲醇，色譜級。

1.2 儀器設備

高壓脈沖電場滅菌設備：EX-1900，廣州市心安食品科技有限公司；方波，二次處理滅菌；自動頂空進樣器（7697A），美國安捷倫公司；氣相色譜-質譜聯用儀（7890B-5975C），美國安捷倫公司；全自動色差儀（CR-400），日本美能達公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菠蘿低醇酒制備要點

挑撿：選取成熟菠蘿，去除壞果、爛果，破碎榨汁，加入60 mg/L 二氧化硫和100 mg/L 果膠酶，取上層汁4 ℃備用；

成分調整：調整菠蘿汁糖度至130～135 g/L，酸度（以酒石酸計）6.20 g/L；取適量果汁加入活性干酵母90 mg/L 于30～35 ℃水浴活化20 min 后使用，在20 ℃控溫發酵；

終止發酵：將發酵至（4.80±0.50）% vol 的菠蘿低醇酒在0 ℃ 4000 r/min 離心10 min，取上清液進行不同終止發酵處理；

澄清：加入300 mg/L 皂土在4 ℃靜置5 d，取上清液膜過濾得到成品。

1.3.2 終止發酵條件的確定

1.3.2.1 脈沖電場終止發酵條件的確定

本實驗中脈沖設備波形為方波，處理室體積0.02 mL，處理頻率1000 Hz，菠蘿低醇酒流速5 mL/s。參照預實驗條件，探討在場強條件10.00 kV/cm、12.50 kV/cm、15.00 kV/cm，有效處理時間40、80、120 μs條件下，脈沖電場終止發酵的有效條件，組別SPEF。

1.3.2.2 熱處理條件的確定

本試驗參照預實驗條件，在75 ℃水浴恒溫熱處理5、10、15、20 min，確定不同條件下酵母菌的殘留量，從而確定熱滅菌法終止發酵的有效條件，組別ST。

1.3.2.3 二氧化硫處理條件的確定

本試驗參照預實驗條件，分別加入100、125、150 mg/L 二氧化硫，確定不同條件下酵母菌的殘留量，從而確定二氧化硫法終止發酵的有效條件，組別SSO2。

1.4 理化分析

根據GB 4789.2-2016方法測定樣品在終止發酵處理前后酵母菌落總數；根據GB 15038-2006 葡萄酒、果酒通用分析方法測定菠蘿低醇酒中總糖、總酸、揮發酸、干浸出物、總二氧化硫含量、感官分析；采用全自動色差儀，測定果酒色澤，以L*、a*、b*表征。采用頂空氣相色譜法（HS-GC）進行酒精度分析。

HS 條件：加熱箱溫度：50 ℃；傳輸線溫度：80 ℃；樣品瓶平衡時間：15 min；恒定流量：50 mL/min，保持時間：0.25 min。

GC 條件：進樣口溫度：230 ℃；檢測器溫度：250 ℃；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持10 min，以10 ℃/min 升溫到210 ℃；分流比：10:1；空氣流量：400 mL/min；尾吹氣流量：25 mL/min；載氣N2流量：30 mL/min；色譜柱：HP-5 氣相色譜柱（30 m×25 mm×25 μm）。

樣品處理：準確稱取0.30 g 氯化鈉，吸取1 mL待測酒樣加入頂空進樣瓶，壓蓋備測。

1.5 HS-SPME-GC-MS 香氣分析

GC 條件：起始溫度40 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升到120 ℃，保持2 min，再以7 ℃/min 升至220 ℃，保持5 min；進樣口、檢測器溫度：250 ℃；載氣為高純氦氣，流速1.00 mL/min；分流比10:1。

MS 條件：EI 離子源；流速：1 mL/min；質量范圍33～350m/z。

樣品處理：準確吸取5 mL 酒樣，10 μL 內標（3.21 mg/L 甲基異丁基甲醇）稱取1.25 g 氯化鈉加入20 mL頂空進樣瓶中，加蓋備測，自動頂空進樣。

1.6 數據處理

采用Origin 2019 軟件繪制圖表，SPSS 24.0 進行相關性和顯著性分析，各項指標以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 滅菌效率

2.1.1 脈沖電場終止發酵法

圖1d 中可以明顯看出，酵母菌致死率lgS 與不同場強條件下的殺菌時間之間符合一級動力學，有良好的線性相關性，隨著場強的增加，k 值越來越小，殺菌越快，這點也與Fermi 模型中k 值的表述一致[7]。具體來看，圖1（a、b、c）中一定范圍內相同場強條件下，處理時間越長，酵母菌致死率越高，在10 kV/cm條件下，當有效處理時間從40 μs 增加至120 μs 時，對酵母菌的致死率約增加了3.5 log。隨著電場強度的提高，殺菌效果顯著增強。由圖1（a、c）可以看出，當場強從10 kV/cm 增加至15 kV/cm 時，在相同有效處理時間40 μs 條件下，酵母菌的致死率約增加了2.3 log。在場強在15 kV/cm、處理時間80 μs 條件下，酒體溫度75 ℃，未檢出酵母菌，達到終止發酵的目的。對照熱滅菌處理需20 min 才能將酵母菌殺滅（表1），而脈沖有效處理時間僅80 μs，故脈沖電場滅菌過程中溫度升高對滅菌效果的影響可忽略。

圖1 不同場強和處理時間對酵母菌的致死情況（a，b，c）和線性關系（d）Fig.1 Lethal conditions of yeasts with different field strengths and treatment times (a, b, c) and Linear relationship (d)

2.1.2 熱滅菌和二氧化硫終止發酵法

Guyot 等[4]研究了釀酒酵母對熱的應激反應。結果表明，溫度一定，加熱速度對酵母沒有顯著性影響，致死率僅與加熱時間相關。由表1 可知，隨著滅菌時間延長，酵母菌落總數急劇下降，在75 ℃處理20 min時，未檢出酵母菌，達到終止發酵的目的。高濃度二氧化硫能抑制酵母菌活動[3]，在濃度為150 mg/L 時酒精發酵終止，此時未檢出酵母菌。

表1 熱滅菌法和二氧化硫法處理低醇酒中酵母菌落總數Table 1 Total number of yeast colonies in low alcohol wine treated by thermal sterilization and sulfur dioxide

2.2 不同終止發酵方式對低醇菠蘿酒理化指標的影響

通過對脈沖電場滅菌、熱處理、添加二氧化硫制備的菠蘿低醇酒的常規理化指標和感官評價進行分析，由表2 可知：三種終止發酵方式均能使果酒達到目標酒精度，達到終止發酵目的，且殘糖、總酸、干浸出物、揮發酸沒有顯著性差異，這與Darra[10]研究結果一致。根據GB 2760-2011 食品添加劑使用標準規定，果酒中二氧化硫最大使用量0.25 g/L（最大量以二氧化硫殘留量計），三種菠蘿低醇酒含量均符合國家標準。即終止發酵方式對菠蘿低醇酒理化指標影響不顯著。

表2 低醇菠蘿酒的理化指標Table 2 Physical and chemical indicators of low alcohol pineapple wine

2.3 不同終止發酵方式對低醇菠蘿酒色澤的影響

表3 低醇菠蘿酒色澤變化Table 3 Color of low alcohol pineapple wine

不同終止發酵方式對果酒色澤的L*值、a*值、b*值差異顯著（p＜0.05），其中L*值、b*值為正值，a*值為負值，說明果酒色澤亮度上升，綠色黃色增強[11]。如表3 所示，SSO2樣L*值最高，L*值常被用來衡量食品的褐變程度，由于二氧化硫的漂白和抗氧化特性，導致果酒亮度明顯提升，脈沖電場處理也具有類似效果，Oms 等[11]研究發現，甜瓜汁在場強35 kV/cm、處理時間為1050 μs 時，甜瓜汁的抗氧化能力達到最高，但效果不如添加二氧化硫顯著。相比之下，熱處理大大增加了低醇菠蘿酒的褐變，是因為酒樣在終止發酵過程中由于溫度的升高還原糖、氨基酸等物質經過縮水、脫水、重排等一系列反應發生褐變[12]，導致亮度降低。因此，脈沖電場法和二氧化硫法終止發酵技術比熱滅菌更適合于低醇菠蘿酒。

2.4 不同終止發酵方式對低醇菠蘿酒香氣成分的影響

圖2 低醇菠蘿酒香氣成分總離子流圖Fig.2 Total ion chromatograms of aroma components of low alcohol pineapple wine

總香氣成分共檢出48 種，其中主要包括21 種酯類香氣物質（44.50%～53.70%），6 種醇類香氣物質（27.30%～40.70%），8 種酸類香氣物質（11.30%～25.70%）。不同終止方式對發酵酒中檢測到的香氣成分含量差異較大。SPEF樣中構成菠蘿重要香成分的2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、3-羥基己酸甲酯、4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮含量均有提升；特有乙酸橙花酯[13]、芳樟醇[14]、D-檸檬烯[15]等物質使酒體具有甜玫瑰橙花花香、蘋果果香、愉悅的檸檬香；壬酸、2-甲基乙酸等[16]酸類品種的增加進一步協調果酒的口感，相較于ST和SSO2酒樣香氣分析表現更好，香氣成分總離子流圖如圖2 所示。

酯類共檢出23 種，是含量最高的一大類。脈沖滅菌樣、熱滅菌樣和二氧化硫滅菌樣的酯類含量分別占總香氣含量的41.50%、43.50%、53.70%，二氧化硫樣的酯類占比量高于其他方式終止發酵處理后的樣品，是由于低沸點酯類在高溫或高壓的處理下揮發所引起的[17]，未檢測到的乙酸乙酯推斷也是因為此。脈沖電場中2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、3-羥基己酸甲酯含量最高，是新鮮菠蘿香味的主要來源，賦予酒體新鮮水果香氣[13]。

醛酮類化合物共檢出6 種，揮發性醛酮給菠蘿酒帶來果香、堅果香和奶香[18]，其中菠蘿香氣成分4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮（0.46 mg/L、0.35 mg/L、0.39 mg/L）賦予菠蘿低醇酒甜的咖啡焦糖香[19]。

醇類化合物共檢測出9 種，脈沖滅菌樣、熱滅菌樣和二氧化硫滅菌樣的醇類含量分別占總香氣含量的27.70%、27.30%、28.50%。果酒中的雜醇油主要包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、活性戊醇、異戊醇和苯乙醇[20]，本研究中發酵過程中產生的苯乙醇，異戊醇是含量最高的兩種醇類，占總醇含量的90%以上，賦予酒體玫瑰香，且使得口感綿軟協調。

酸類化合物共檢出8 種，脈沖滅菌樣、熱滅菌樣和二氧化硫滅菌樣的酸類含量分別占總香氣含量的23.70%、21.90%、11.30%。脈沖終止樣中酸類成分檢出最多（8 種，16.12 mg/L），包括壬酸、2-甲基己酸、3-(4-乙基苯甲酰)丙酸、4-(2-羥基-乙基氨基)呋喃-3 羧酸，可使酒樣口感飽滿、醇厚，增加酒體層次感[19]。

其它化合物：除以上化合物外，果酒揮發性香氣中還含有8 種其它化合物，包括有特殊香氣的苯乙烯，僅在脈沖樣中檢出的D-檸檬烯有新鮮橙子香氣和檸檬香氣[14]。

表4 低醇菠蘿酒主要揮發性香氣成分Table 4 Main volatile aroma components of low alcohol pineapple wine

注：nd 表示未檢出該香氣物質。

2.5 感官分析

圖3 低醇菠蘿酒感官分析雷達圖Fig.3 Sensory analysis radar chart of low alcohol pineapple wine

圖3是SPEF、ST、SSO2三組不同終止發酵方式釀造菠蘿低醇酒感官分析雷達圖。從香氣指標分析，SPEF組菠蘿低醇酒評分9.5 分，有典型菠蘿香氣，風味獨特，這是由于脈沖電場滅菌樣提高了酯類、高級醇種類和含量，豐富了菠蘿低醇酒香氣的復雜性和層次感；SSO2組酒體具有硫磺味，臭雞蛋味等不愉悅氣味，評分8.5 分。從外觀指標分析，SPEF組色澤評分最高，9.2 分。從滋味指標分析，三組酒樣的甜味、酸味基本一致，沒有顯著性差異。因此，采用脈沖電場滅菌法制備的低醇菠蘿酒具有更好的感官品質。

3 結論

終止發酵方式對低醇酒生產至關重要。本文對脈沖電場滅菌、熱處理和添加二氧化硫等終止發酵條件進行探討，結果表明當場強在15 kV/cm，有效處理時間80 μs 或75 ℃恒溫水熱20 min 或添加150 mg/L 二氧化硫可達到終止發酵的目的。相較于兩種傳統終止發酵法，脈沖電場滅菌制備的菠蘿低醇酒在色澤上L*值、a*值升高，b*值降低，表明酒體亮度上升，綠色褪去，有效保持果酒色澤；在香氣成分含量上，SPEF樣中構成菠蘿重要香成分的2-甲基丁酸甲酯、2-甲基丁酸乙酯、丁酸乙酯、3-羥基己酸甲酯、4-羥基-2，5-二甲基-3(2H)-呋喃酮含量均有提升。綜上所述，采用脈沖電場滅菌法能有效終止發酵，改善果酒色澤，增加菠蘿酒香氣復雜，果酒具有良好的感官品質。