糠醛渣復合材料固定果膠酶的制備

畢淑嫻，郝紅英，汪明圓，詹海鵑，劉萬毅

（省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室，化學國家級實驗教學示范中心，寧夏大學化學化工學院，寧夏銀川 750021）

伴隨著生活品質的提高，人們對果品質量要求也越來越高[1]。作為世界四大酶制劑之一的果膠酶在一定程度上解決了果汁和果酒的澄清，脫除果膠，加工過程中營養物質損耗等難題，降低了水果等榨汁的粘度，提高了過濾效率，同時化學澄清劑用量的減少也改善了果汁的質量。果膠酶也廣泛的應用于醫藥領域、食品行業、生物傳感器、環境保護及能源利用、生物脫膠、紡織等領域[1-4]。果膠酶主要來源于多種微生物體內，也可以通過液體深層培養或固體培養法獲得。游離的果膠酶有反應后不能回收,不能實現重復利用的缺點。而固定化酶在一定程度上彌補了這些缺點，還能防止外源物質對果品的污染，提高酶的使用效率[5-9]。

糠醛渣是玉米芯、稻殼、等農副產品加工剩余物中聚戊糖成分高溫水解生產呋喃甲醛后得到的固體廢渣，含有大量的纖維素、半纖維素和木質素，具有良好的在利用價值[10-12]。本實驗糠醛渣復合材料和磺化糠醛渣復合材料采用戊二醛交聯法固定果膠酶，操作簡單，易于實現糠醛渣的主要成分是纖維素、木質素和半纖維素，含有大量的羥基、羧基等官能團，經磺化后的糠醛渣，在其組分分子中引入磺酸基，賦予其很好的化學反應活性，此外，糠醛渣來源廣，價格低廉，有較好的化學穩定性，無毒。利用糠醛渣固定果膠酶不僅可以實現資源化利用，又可為糠醛渣在固酶方面的實際應用提供一定的理論基礎和參考依據。

本文以糠醛渣復合材料作為酶的固定化載體，對果膠酶的催化性能進行了研究。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

糠醛渣：寧夏共享化工集團；乙酸：煙臺市雙雙化工有限公司；殼聚糖：國藥集團化學試劑有限公司；戊二醛：上海中秦化學試劑有限公司；苯胺：天津市凱通化學試劑有限公司；98%的3-氨基苯硼酸鹽酸鹽：上海麥克林生物科技有限公司；聚乙烯醇：天津市凱通化學試劑有限公司；過硫酸銨：煙臺市雙雙化工有限公司；鹽酸：天津市北聯精細化學品開發有限公司；98%的硫酸：天津市科密歐化學試劑有限公司；檸檬酸：徐州天鴻化工有限公司；檸檬酸鈉：上海廣諾化學科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鈉：上海中秦化學試劑有限公司；苯酚：煙臺市雙雙化工有限公司；無水亞硫酸鈉：上海廣諾化學科技有限公司；氫氧化鈉：天津市風船化學試劑科技有限公司；97%D-(+)-半乳糖醛酸：阿拉??；果膠、果膠酶：上海瑞永生物科技有限公司。

1.2 儀器

HJ-6 多頭磁力加熱攪拌器：常州國華電器有限公司；JD200-4 電子分析天平：沈陽龍騰電子有限公司；DHG-9053A 型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；KQ-250E 醫用數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；KA-1000 低速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；Nicolet IS10 傅立葉變換紅外光譜儀：賽默飛世爾科技公司；S-4800 場發射掃描電子顯微鏡：日本日立公司；SHA-C 水浴恒溫振蕩器：金壇市杰瑞爾電器有限公司；SX723 型便攜式pH/mV/電導率測量儀：上海三信儀表廠；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州長城科工貿有限公司；冰箱：青島市海爾集團有限公司；UV-1800PC 紫外可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司。

1.3 糠醛渣復合材料的制備

先用大量的自來水反復沖洗掉糠醛渣表面的雜質和水溶物，80 ℃烘干24 h，在粉煤機上破碎，過篩，得60~80 目顆粒備用。再用大量的自來水反復沖洗掉糠醛渣表面的雜質和水溶物，80 ℃烘干24 h，破碎過篩得60~80 目顆粒備用。最后將4%戊二醛(GA)和1.0 g 糠醛渣-CTS 復合材料超聲20 min，磁力攪拌交聯10 h后離心洗滌，80 ℃烘干12 h，制得糠醛渣-CTS-GA復合材料。將上述材料逐滴加入3 mL 濃H2SO4，磁力攪拌30 min，室溫放置48 h 后150 ℃反應4 h，自然冷卻，洗滌至濾液pH 為中性，80 ℃烘干12 h，研磨制得磺化糠醛渣材料。然后與2%殼聚糖，超聲20 min 混合均勻后，磁力攪拌12 h 離心洗滌，80 ℃烘干12 h，制得磺化糠醛渣-CTS 復合材料。最后與4%戊二醛交聯10 h 后，80 ℃烘干12 h，制得磺化糠醛渣-CTS-GA 復合材料。

1.4 固定化果膠酶的制備

分別稱取0.05 g 糠醛渣-CTS-GA 復合材料，0.05 g磺化糠醛渣-CTS-GA 復合材料于10 mL 離心管中，依次加入1%果膠酶2 mL、2 mL、4 mL，在水溫為37 ℃的恒溫振蕩器上震蕩4 h 后取出離心，上清液保留，將上清液與固定酶放置于4 ℃冰箱保存。

1.5 果膠酶酶活力及載酶量測定

1.5.1 游離酶及固定化果膠酶酶活力測定

將游離酶及固定化果膠酶與果膠迅速搖勻，在40 ℃水浴中反應30 min 后，分別加入2 mol/L NaOH溶液5 mL，DNS 試劑1.5 mL，沸水煮沸5 min。分別取2 mL 反應液于10 mL 比色管后稀釋至刻度線，2號試管中溶液為參比，測吸光度。

1.5.2 固定化果膠酶載酶量的測定

25 mL 比色管中分別加入糠醛渣復合材料固定化果膠酶0.05 g（磺化糠醛渣復合材料固定化果膠酶0.05 g）未固定果膠酶（上清液）1 mL，5%果膠酶1 mL；分別加入pH=3.5 緩沖溶液和1%果膠，在40 ℃水浴中反應30 min 后，分別加入2 mol/L NaOH 溶液5 mL，DNS 試劑1.5 mL，沸水煮沸5 min，稀釋至刻度線后測吸光度。兩種固定化酶的比酶活分別為106.32 和128.79 u/mg，其中糠醛渣復合材料固定化果膠酶載酶量為197.2 mg/g。

1.6 數據處理

實驗數據以平均值±標準差（±s）表示，其中通過5 組平行實驗所得。數據穩定性用變異系數CV（CV=s/）表示，其中CV>100%為強變異；10%

2 結果與分析

2.1 載體的制備及表征

糠醛渣在反應釜中經濃H2SO4高溫磺化后制得磺化糠醛渣，與未經處理的糠醛渣利用靜電自組裝技術包裹2%殼聚糖后交聯4%戊二醛，制備出兩種具有多醛基的固定酶載體。從FT-IR 譜圖1 可得：①在3339 cm-1處為纖維素、木質素和半纖維素O-H 鍵伸縮振動吸收峰，2900 cm-1處為C-H 鍵的伸縮振動；②在1696和1594 cm-1還出現了C=O 和C=C 的伸縮振動峰，并且峰向低波數方向偏移，這表明糠醛渣經磺化后，碳骨架發生了一定程度的改變；③1155 cm-1處出現了新的振動吸收峰，是由于糠醛渣經過H2SO4磺化后產生的SO3H 所造成的。

圖1 糠醛渣（a）和磺化糠醛渣（b）紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of furfural residue (a) and sulfonated furfural residue (b)

圖2 糠醛渣（a）和糠醛渣-CTS-GA（b）紅外光譜圖Fig.2 FT-IR spectra of furfural residue (a) and furfural residue CTS GA (b)

由糠醛渣和糠醛渣-CTS-GA的紅外光譜圖2可得到以下結論：①在1683 cm-1處出現了新的吸收峰，并且峰強度很大，是殼聚糖的氨基與戊二醛的醛基發生Schiff 反應而形成的Schiff 堿鍵（C=N）的吸收峰和戊二醛沒有參與反應的另一個C=O 伸縮振動所產生的；②1020 cm-1處的吸收峰也明顯增強，是由N-H和N-C 的彎曲振動以及沒有完全反應完的SO3H 引起的；③殼聚糖中的O-H 和N-H 的伸縮振動使得3333 cm-1處的吸收峰明顯增強，2900 cm-1處的C-H 的伸縮振動吸收峰也有一定程度的增強。

圖3 為糠醛渣（a）、磺化糠醛渣（b）的SEM 圖，從圖a 和圖b 的對比可知，不經過任何處理的糠醛渣表面較平整，幾乎沒有孔道結構，經磺化后表面變得粗糙，出現溝壑和明顯缺陷。在包裹殼聚糖交聯戊二醛后，表面變得疏松，出現了層狀結構。

圖3 糠醛渣復合材料和磺化糠醛渣復合材料SEM 圖Fig.3 SEM of furfural residue composite and sulfonated furfural residue composite

2.2 酶濃度對固定化果膠酶酶活力的影響

圖4 不同酶濃度對酶活的影響Fig.4 Effect of different enzyme concentration on enzyme activity

對于純酶來說，一般認為在pH、反應溫度和反映底物濃度相同時，酶的催化能力與酶的濃度成正比關系，由圖4 可見，果膠酶自由酶幾乎符合上述理論。對于兩種固定酶都有共同的趨勢，當給酶量達到一定程度后固定酶的催化能力都開始下降。由于載體的結合位點有限，給酶量過大時，造成載體的空間位阻過大，底物與產物不能夠在第一時間分散，從而使得固定酶的催化能力降低。固定酶-1，固定酶-2 的最佳酶濃度依次為50 mg/mL，20 mg/mL。在達到最佳酶濃度之前，固定酶-1 的酶活力受酶濃度的影響較大，固酶酶濃度為5 mg/mL時的酶活力為最佳酶濃度固定酶的81.33%。

2.3 pH 對固定化果膠酶酶活力的影響

酶是一種蛋白質，反應體系的pH 影響酶分子活性部位中催化基團與結合基團的解離狀態，同時也影響著底物的解離狀態，對酶分子的空間結構和專一性也有一定的影響。由圖5 可見，反應體系的pH 對自由酶和固定酶的酶活力影響很大，兩種固定酶的最佳pH 均為3.5，自由酶的最佳pH 為4.0。自由酶的pH-酶活力曲線呈鐘形，而固定酶受微環境表面電荷的影響，曲線發生偏移。反應體系pH 為2.6 時，相對酶活力仍為95.50%。由于酶蛋白質中的-NH2與戊二醛的醛基之間的加成反應，也需要在酸性環境中進行；偏離最適pH 也會引起酶蛋白的部分失活。兩種固定酶在超過最佳pH 后酶活力都有明顯的下降，可能是由于果膠酶與載體材料相互作用，使得酶分子的空間構象發生較大改變。固定化果膠酶與游離酶相比，在偏酸條件下能保持更高的酶活力。

圖5 pH 對固定化果膠酶酶活力的影響Fig.5 Effect of pH on the activity of immobilized pectinase

2.4 果膠濃度對固定化果膠酶酶活力的影響

圖6 果膠濃度對固定化果膠酶酶活力的影響Fig.6 Effect of pectin concentration on activity of immobilized pectinase

由圖6 可見，對于自由酶，當果膠濃度達到10 mg/mL 時，繼續增大果膠溶液濃度自由酶酶活力幾乎不變，并且在4 mg/mL~20 mg/mL 果膠濃度范圍內，酶活力所受影響并不明顯，酶已被底物飽和；對于固定酶-1 和固定酶-2，當果膠濃度分別達到15 mg/mL、10 mg/mL 時，達到相對酶活的100%。超過相應的最佳果膠濃度時，酶活力顯著下降，當果膠濃度分別達到20 mg/mL、12 mg/mL 時，相對酶活分別為73%、55%?？傮w來說，兩種固定酶受果膠濃度的影響較大。當果膠濃度達到一定程度時，還原糖含量不再增加，這時出現了底物過飽和現象，當底物濃度低時，固定化酶分子的活性位點未被底物飽和，但當底物的分子數目增加時，固定化酶分子活性位點和底物結合直至過飽和，固定化酶不再有活性位點可以結合[13]。

2.5 反應溫度對固定化果膠酶酶活力的影響

圖7 反應溫度對固定化果膠酶酶活力的影響Fig.7 Effect of reaction temperature on the activity of immobilized pectinase

同于一般化學反應，當溫度升高，酶解反應速率會加快，同時酶的活性也會隨之降低。由圖7 可見，自由酶，固定酶-2 的最適反應溫度均為50 ℃，固定酶-1 的最適反應溫度為45 ℃。自由酶在25 ℃~50 ℃，受溫度影響較小，25 ℃時相對酶活仍為93.62%，但耐高溫能力不強。固定酶-1 和固定酶-2 的酶活力受溫度的影響，酶活力波動較大。固定酶-2 耐高溫性能更強，70 ℃時相對酶活為92.54%。與利用Fe3O4磁核與海藻酸鈉明膠制備磁性復合載體固定化果膠酶具有相同的熱穩定性[14]。

2.6 反應時間對固定化果膠酶酶活力的影響

由圖8 可見，自由酶的最佳反應時間為90 min，固定酶-1 的最佳反應時間均為120 min，固定酶-2 的最佳反應時間為60 min，且反應時間對其相對酶活影響較大。四種酶在達到最佳反應時間酶活力都有所下降，可能是由于產物分解為其他物質的原因。

圖8 反應時間對固定化果膠酶酶活力的影響Fig.8 Effect of reaction time on the activity of immobilized pectinase

2.7 固定化果膠酶的操作穩定性

圖9 固定化果膠酶的操作穩定性Fig.9 Operational stability of immobilized pectinase

能夠回收，重復循環使用是固定化酶的一個重要優點，由圖9 可見，固定酶-1，固定酶-2 這兩種固定酶在循環使用8 次后，仍然保持著較高的相對酶活，分別為81.78%、78.90%。這說明以糠醛渣復合材料，磺化糠醛渣復合材料為載體制備的固定化果膠酶有較好的重復使用性。而用磁性殼聚糖微載體固定的果膠酶，重復使用6 次后，酶活力只剩余4%[15]。

2.8 固定化果膠酶的儲存穩定性

如圖10 所示，在4 ℃的環境下，兩種固定酶隨著儲存時間的延長，相對酶活都有所下降，固定酶-1和固定酶-2 在儲存32 d 后，相對酶活分別下降了27.98%和11.02%，均具有較好的儲存穩定性，其中固定酶-2 尤為突出。固定化果膠酶的存儲穩定性明顯優于HPD-750 大孔樹脂為載體材料固定化果膠酶[16]。

圖10 固定化果膠酶的儲存穩定性Fig.10 Storage stability of immobilized pectinase

3 結論

以洗凈、干燥、粉碎后的糠醛渣為原材料，在高溫條件下，于反應釜中經98%濃H2SO4磺化后制得磺化糠醛渣，磺化糠醛渣與未經處理的糠醛渣利用靜電自組裝技術將殼聚糖包覆到原材料上，制備出具有多醛基、表面粗糙的糠醛渣和磺化糠醛渣復合材料，兩種復合材料通過和戊二醛交聯均能有效的固定果膠酶。與游離酶相比，固定化果膠酶的最佳pH 值低0.5，更耐酸性；固定化酶的熱穩定性也有了很大提升，特別是磺化糠醛渣復合材料固定化果膠酶耐高溫性能更強，70 ℃時相對酶活為92.54%。兩種固定酶的相對酶活可達95.52%和95.03%，在最佳反應條件下兩種固定酶的最大載酶量分別為197.20 mg/g，60.40 mg/g。其中糠醛渣復合材料的固定化果膠酶在重復循環使用8 次后剩余相對酶活可達81.78%，磺化糠醛渣復合材料的固定化果膠酶在4 ℃下儲存32 d后仍剩余88.98%的相對酶活。兩種固定酶都表現出較好的操作穩定性和儲存穩定性，有較好的經濟價值和應用前景。