人源Lactobacillus reuteri 協同發酵薏米酸奶的品質分析

朱曉麗，楊周潔，文安燕，秦禮康

（1.貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽 550025）（2.貴州大學生命科學學院，貴州貴陽 550025）

益生菌（probiotics），作為改善寄主腸道微生態作用的活性微生物[1]，具有增強免疫力[2]、降低膽固醇和延緩衰老[3]等作用。酸奶具有良好的生理功能和豐富的營養物質，是開發功能性食品的理想選擇[4]。含有益生菌的酸奶有改善胃腸道[5]和降血脂[6]功效。益生菌產品以乳制品為主，益生菌發酵的酸奶將益生菌本身的發酵性能與酸奶的保健功效結合達到協同作用[7]。益生菌乳制品主要有發酵乳、乳酸菌飲料、干酪、酸奶、乳飲料、奶粉和冰淇淋等等[8]，酸奶產品中益生菌的添加為消費者提供了有益的功能[9]。

薏苡（Coixlacryma-jobiL.）為禾本科玉蜀黍族薏苡屬，被譽為“世界禾本科植物之王”，其成熟種仁稱為“薏米”[10]。薏米富含蛋白質、脂肪、淀粉、礦物質、維生素等營養成分，以及薏仁酯、薏仁油、三萜、谷甾醇、生物堿等活性成分，薏米有降壓、降糖、消炎、抑制癌細胞增殖等生理功能[11]。薏米被應用于各種功能保健食品，研究發現，薏米漿與鮮奶發酵后，營養成分更豐富，口味更好[12]。

目前，市售的酸奶大多采用Lactobacillus bulgaricus和Streptococcus thermophilu發酵，但它們耐酸耐膽鹽及粘附定殖效果較差，有益作用受到限制[13]。Lactobacillus reuteri作為益生菌已經被我國批準可用于乳制品、保健食品[5]，它有止瀉[14]、增強機體免疫[15]、拮抗病原微生物[16]和調節腸道菌群[17]等功能。同時，Lactobacillus reuteri耐酸耐堿能力較強，為其在腸道內定殖并發揮益生功能創造必要條件[13]。從前期實驗對適合羅伊氏乳桿菌生長的功能谷物的篩選得出，薏米能顯著促進Lactobacillus reuteri的生長，活菌數量級高達1013cfu/mL，羅伊氏乳桿菌單菌株發酵存在凝乳效果差的缺點。因此，本文采用Lactobacillus reuteri分別與Streptococcus thermophilus和Lactobacillus bulgaricus協同發酵制備薏米酸奶，剖析其理化指標、質構特性、滋味及揮發性風味物質，以期為Lactobacillus reuteri的應用及薏米產品的深入研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lactobacillus reuteri（保藏號BNCC No：186563）購于北京北納創聯生物技術研究院；Streptococcus thermophilus（保藏號CICC No：6247）購于中國工業微生物菌種保藏管理中心；Lactobacillus bulgaricus（保藏號GDMCCNo：1.155）購于廣東省微生物保藏中心；薏米、鮮牛奶、白砂糖均市售，MS 培養基、MS 肉湯培養基、酚酞、氫氧化鈉、酒石酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、草酸、磷酸、磷酸二氫鉀等均為分析純。

1.2 儀器與設備

Pegasus HRT 4D Plus（LECO，USA）全二維氣相-高通量高分辨質譜聯用儀；1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；TS-500Z 電子舌味覺分析系統，日本Insent 公司；TMS-Pro 質構分析儀，美國Food Technology Corporation 公司；JK9870 全自動凱氏定氮儀；pH-25 型pH 計，上海今邁儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 薏米酸奶的制備

以1:5 的料液比加入純凈水浸泡薏米24 h，煮1.5 h，打漿，加0.3%（中溫）α-淀粉酶，55 ℃糊化1 h，加入0.5%糖化酶58 ℃糖化50 min，120 目尼龍布過濾。6%白砂糖、薏米漿30%、鮮牛奶混合均質。95 ℃下滅菌5 min，冷卻，接入5% 1:1:1 的菌種，41 ℃發酵6 h，酸奶于4 ℃冷藏24 h，得到薏米酸奶成品。

表1 樣品詳細信息Table 1 Sampledetails

表2 薏米酸奶理化指標Table 2 Physical and chemical indexes of semen coicis yogurt

表3 薏米酸奶質構分析Table 3 Texture analysis of semen coicis yogurt

1.3.2 常規理化指標測定

滴定酸度參照LIM[18]方法；持水率參考FENGC[19]方法；手持pH 計測定pH 值；活菌數的測定采用平板計數法；蛋白質含量的測定參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》。

1.3.3 TPA 測試

酸奶的質構測定參考FANG T[20]等的方法略作修改，測試采用連接25N 感應元的質構儀，使用直徑為50 mm 探頭，測試速率60 mm/min、形變量30%。

1.3.4 有機酸測定

有機酸的測定參照王雪艷[21]等的方法略作修改。色譜條件：磷酸二氫鉀溶液（0.02 mol/L）；柱溫：35 ℃；檢測波長：210 nm；進樣量：10 μL；流速：1 mL/min。

1.3.5 電子舌的測定分析

電子舌的測定分析參考王一然[22]的方法略作修改，取適量體積的酸奶5000 r/min 離心10 min，加2倍體積的超純水稀釋，取25 mL于電子舌專用杯測定。

1.3.6 揮發性風味物質的測定

揮發性風味物質的測定參MOINEAU-JEAN A[23]的方法略作修改，采用SPME-GC-MS 技術對酸奶進行定性及定量分析。

1.3.7 數據處理

采用SPSS 22.0和Excel處理軟件對數據進行統計分析，實驗重復三次，Duncan 檢驗法進行差異顯著性分析，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 理化指標

酸奶的pH 和滴定酸度取決于菌種種類、接菌比例和菌種產酸能力，酸度是衡量酸奶品質的重要指標[24]。由表2 可以看出，薏米酸奶pH 在4.04～4.43，滴定酸度在80.66～96.65 °T，而RTB 滴定酸度是80.66 °T，顯著低于其他兩菌發酵的酸奶（p＜0.05），這與溫夏萍[25]研究結論一致，Lactobacillusreuteri發酵乳糖主要產生乳酸、碳酸和乙酸，碳酸不穩定易分解成二氧化碳揮發；薏米酸奶持水率在36.76%～44.80%，TB 的持水率為44.80%，顯著高于RTB、RT 和RB（p＜0.05）；RTB 中活菌數達到9.99 log cfu/mL，顯著高于2 株菌發酵的酸奶，這與前期實驗結果一致，薏米促進Lactobacillus reuteri的生長（p＜0.05）；薏米酸奶的蛋白質含量無顯著差異（p＜0.05）。

2.2 TPA

酸奶的硬度、彈性和內聚性是評價其質構特性的重要指標[26]。酸奶的凝乳結構主要是由酪蛋白、脂肪和乳清三部分形成的三維網狀凝膠結構[22]。由表3 可知，RTB 酸奶咀嚼性（0.45 mj）、內聚性（0.77 Ratio）、膠黏性（0.05 N）均顯著高于其他三個組，而硬度（0.69 N）、彈性（8.99 mj）顯著高于RT 和RB，略低于TB（p＜0.05），說明3 株菌發酵賦予薏米酸奶柔和的口感，表明3 株菌發酵薏米酸奶的整體凝固性較好，較黏稠，符合凝固型酸奶質構特性。

2.3 有機酸成分分析

有機酸與發酵乳品質緊密相關[27]。由表4 可知，RTB、RT、RB和TB中有機酸含量分別是14.27、15.08、14.92、21.04 mg/mL。TB 中乳酸、檸檬酸含量最高，RTB 中乙酸（0.79 mg/mL）含量顯著高于其它兩菌發酵的酸奶（p＜0.05），RB 中草酸（0.26 mg/mL）和酒石酸（0.84 mg/mL）含量最高。這與陳永福[28]研究結論一致，乳酸和檸檬酸是酸奶中的主要有機酸，酸奶的乳酸和檸檬酸與滴定酸度呈正相關，乙酸與滴定酸度呈負相關，這解釋了RTB 中滴定酸度低和pH 高的結果。

表4 薏米酸奶中有機酸分析（mg/mL）Table 4 Analysis of organic acids in semen coicis yogurt

2.4 電子舌

滋味是由酸、咸、鮮、甜、苦味組合而成，在酸奶中，這些人體能夠鑒別的基本味覺主要由酸奶中非揮發性物質的組成及含量有關[29]。由圖1 可知，四個樣酸、甜、苦、鮮和咸味覺響應值均存在差異，酸味差異性最大，其次是鮮、咸、苦、甜澀（p＜0.05），RTB甜味和鮮味最強，苦味、澀味和酸味最弱。

圖1 酸奶味感雷達圖Fig.1 Yogurt taste radar map

2.5 揮發性風味物質分析

圖2 薏米酸奶香氣成分GC-MS 分析總離子流色譜圖Fig.2 Chromatogram of total ion flow of semen coicis yogurt aroma components analyzed by gc-ms

醇、醛、酮、酸、脂等共同決定了酸奶的風味[30]，風味是決定酸奶的可接受性和選擇性的重要因素[31]。由表5 可知，RTB、RT、RB 和TB 檢測出總的風味物質依次為81 種（1331.74 ng/mL）、68 種（448.88 ng/mL）、73 種（388.74 ng/mL）和50 種（808.31 ng/mL），加入Lactobacillus reuteri提高了薏米酸奶的風味物質種類和含量。

酸類物質是酸奶重要的風味物質，主要表現在酸奶的滋味上，RTB、RT、RB 和TB 檢測出的酸分別為11 種（467.31 ng/mL）、10 種（224.58 ng/mL）、10 種（149.16 ng/mL）和8 種（263.06 ng/mL），酸奶樣品中檢測到含量較高的四種酸分別是辛酸、己酸、葵酸（87.52 和乙酸，且RTB 中辛酸（134.13 ng/mL）、己酸（100.42 ng/mL）、葵酸（87.52 ng/mL）和乙酸（84.67 ng/mL）顯著高于其它2 株菌發酵的酸奶（p＜0.05），RTB 中乙酸含量較高這與Vénica C I 研究一致，益生菌通過異發酵途徑生產乙酸有關[32]。癸酸能增加酸奶奶香味，己酸具有的椰果香味，戊酸表現出奶油香味，丁酸、庚酸具有奶酪香[33]。這些特殊的酸賦予了薏米酸奶獨特的味道。

醇類物質的閾值較高，對酸奶風味物質的影響很小，但是醇可轉化為酸，也是必不可少的一類物質。RTB、RT、RB 和TB 檢測出的醇依次為18 種（167.75 ng/mL）、11 種（108.16 ng/mL）、14 種（85.11 ng/mL）、10 種（104.09 ng/mL）。四個樣中含量較高的四種醇分別是乙醇（38.16 ng/mL）、2-壬醇（53.43 ng/mL）、2,3 丁二醇（28.65 ng/mL）和4-庚醇（11.70 ng/mL），2-壬醇和4-庚醇在RTB 中最高，乙醇和2,3 丁二醇在RT 中最高。

酮類物質由多不飽和脂肪酸的氧化、熱降解，氨基酸降解或微生物代謝產生[34]。RTB、RT、RB 和TB檢測出的酮依次為14 種（599.11 ng/mL）、10 種（21.18 ng/mL）、9 種（51.86 ng/mL）、10 種（388.83 ng/mL）；酸奶在發酵過程中經過復雜的生物化學反應，使酸奶具有特有的風味，在所有風味物質中2-壬酮含量最高，為341.94 ng/mL，它能夠給酸奶提供獨有的清香味，RTB 中2-壬酮含量顯著高于其它兩菌發酵酸奶。3-羥基-2-丁酮具有濃郁的奶香味，在RTB 中含量最高，達到34.81 ng/mL；丁二酮具有濃郁的奶油味，在RTB中含量最高，達到3.34 ng/mL；2-庚酮有類似梨的水果香味，在RTB 中含量為111.62 ng/mL 顯著高于其它兩菌發酵酸奶。2,3-戊二酮具有奶油、焦糖香氣，并帶有堅果香，只在RTB 中檢測到。

表5 薏米酸奶主要風味物質種類與含量分析Table 5 Main flavor substances and content analysis of semen coicis yogurt

烯烴類酮類36 11.15 甲酸己酯 - 3.68±0.04a - -37 11.76 辛酸甲酯 C9H18O2 - 0.28±0.02a - -38 12.36 辛酸乙酯 C10H20O2 0.02±0.01c 0.64±0.01a 0.16±0.01b -39 14.88 苯甲酸甲酯 C8H8O2 0.42±0.04d 1.23±0.01a 0.69±0.05c 0.81±0.01b 40 15.39 苯甲酸乙酯 C9H10O2 0.36±0.02a 0.15±0.01c 0.19±0.01b -41 15.85 丙烯酸異冰片酯 C13H20O2 0.23±0.04c 0.93±0.03a 0.45±0.03b -42 17.06 乙酸-5-十二烯醇酯 C14H26O2 - - - 5.37±0.11a 43 17.57 2,2,4-三甲基-1,3-戊二醇二異丁酸酯 C16H30O4 0.54±0.01a - - 0.54±0.05a 44 17.67 2-甲基丙酸酯 C12H24O3 - - 0.14±0.01a -45 18.42 馬來酸二丁酯 C12H20O4 - 0.17±0.02a - -46 20.81 硬脂酸甲酯 C19H38O2 - - - 0.40±0.02a 47 20.81 棕櫚酸甲酯 C17H34O2 1.09±0.02a 0.71±0.01b 0.70±0.02b -48 20.86 丁位癸內酯 C10H18O2 - 0.89±0a - -49 21.14 棕櫚酸乙酯 C18H36O2 39.61±0.79a 31.80±0.47b 22.56±0.31c 15.60±0.51d 50 22.35 酞酸二乙酯 C12H14O4 - 0.54±0.31a 0.07±0.00b -51 23.33 反油酸乙酯 C20H38O2 9.32±0.13a 6.74±0.16b 4.76±0.12c 2.64±0.07d小計 53.44±1.13a 49.38±1.30a 30.36±1.03b 25.41±1.13d 52 8.93 雙戊烯 C10H16 0.45±0.09a 0.19±0.01b - -53 9.94 苯乙烯 C8H8 0.49±0.10a 0.56±0.06a 0.37±0.02b 0.35±0.05b 54 12.68 2,4-二甲基苯乙烯 C10H12 - - 0.55±0.42a -55 13.46 氟乙烯 C2H3F - - 0.08±0.00a -小計 0.93±0.01a 0.76±0.01b 1.01±0.03a 0.35±0.05b 56 5.50 2,3-丁二酮 C4H6O2 3.34±0.11a 2.54±0.09b 2.01±0.07c 1.39±0.10d 57 5.50 2-戊酮 C5H10O 5.38±1.04a 58 6.73 2,3-戊二酮 C5H8O2 0.25±0.01a - - -59 8.23 3-庚酮 C7H14O - 0.14±0.00a 0.03±0.00b -60 8.72 2-庚酮 C7H14O 111.62±0.73a 4.66±0.04c 9.6±0.56c 54.33±1.11b 61 9.11 4-甲基-2-己酮 C7H14O 1.13±0.00a - - -62 9.84 5-甲基-3-庚酮 C8H16O - 0.17±0.01a - -63 10.36 3-羥基-2-丁酮 C4H8O2 34.81±1.58a 4.64±0.13c 4.45±0.12c 20.60±0.73b 64 11.40 2-羥基-3-戊酮 C5H10O2 0.42±0.01a - - -65 11.79 2-壬酮 C9H18O 341.94±3.11a 6.34±0.48d 24.01±0.67c 243.80±3.63b 66 14.47 甲基壬基甲酮 C11H22O 84.66±1.17a 3.29±0.03d 9.90±0.20c 47.38±1.05b 67 15.25 苯乙酮 C8H8O 0.53±0.01a 0.39±0.07b 0.24±0.05c 0.25±0.04c 68 16.85 2-十三烷酮 C13H26O 17.10±1.23a 0.87±0.03d 2.49±0.13c 9.54±0.45b 69 17.34 香葉基丙酮 C13H22O 0.68±0.05a - 0.14±0.02b -70 19.00 2-十五烷酮 C15H30O 2.74±0.23a - - -71 19.01 十七烷酮 C17H34O 0.12±0.01c 0.58±0.04b - 1.19±0.03a 72 23.25 2,6-二苯亞甲基環己酮C15H29NO3 1.60±0.02b - - 4.97±0.02a小計 599.11±4.18a 21.18±0.71d 51.86±1.31c 388.83±3.81b

注：“-”表示未檢出。

酯類物質是酸奶的重要風味物質。酸奶酯類物質主要通過脂肪酸水解以及微生物的代謝生成，特別是原料乳中的短鏈脂肪酸水解會產生甲基酮和內酯，能夠直接影響酸奶的整體風味。RTB、RT、RB 和TB中檢測出的脂為11 種（53.44 ng/mL）、14 種（49.38 ng/mL）、12 種（30.36 ng/mL）、6 種（25.41 ng/mL）。乙酯類化合物具有水果花香味，可減少酸奶的苦味和酸味[35]，在RTB 中含量最高，為50.73 ng/mL，這與前文RTB 中滴定酸度最低、有機酸含量最低和質構中苦味最弱結果一致。

醛類物質是酸奶中重要的風味物質。RTB、RT、RB 和TB 中出的醛為6 種（14.18 ng/mL）、4 種（10.31 ng/mL）、7 種（36.21 ng/mL）、6 種（9.85 ng/mL）。壬醛會產生蠟香、蜂蜜香等，在RT 中含量最高，為4.21 ng/mL；癸醛微甜，有類似于甜橙油和玫瑰油的味道，散發出新鮮的柑橘皮的清香味，只在RTB 中檢測出。

綜上，3 株菌發酵酸奶的醇、酸、脂、酮都顯著高于其他2 株菌發酵的樣品，對3 株菌發酵酸奶貢獻性較大的是酮類、酸類，含量最大的四種物質是2-壬酮（341.94 ng/mL）、2-庚酮（111.62 ng/mL）、辛酸（134.13 ng/mL）、己酸（100.42 ng/mL）。3 株菌發酵中的醇、酸、脂、酮等含量分布較為分散、合理，3株菌發酵提高了酸奶風味物質種類和含量，3 株菌發酵的酸奶風味更均衡。

3 結論

3 株菌協同發酵顯著提高酸奶的活菌數（9.99 log cfu/mL）、咀嚼性（0.45 mj）、內聚性（0.73 Ratio）、膠黏性（0.05 N）、乙酸含量（0.79 mg/mL）、甜味和鮮味味覺響應值，顯著減弱酸奶的苦味、澀味、酸味味覺響應值（p＜0.05）；3 株菌發酵酸奶的風味物質為81 種（1331.74 ng/mL），種類、含量顯著高于2 株菌發酵的酸奶，且其中的醇、酸、酸、酮含量都顯著高于兩菌發酵的樣品（p＜0.05）。3 株菌協同發酵薏米酸奶的整體凝固性較好、質構特性較好、滋味適中、風味物質種類較多和含量較高，并且酸奶具有薏米獨特的谷物香味，為Lactobacillus reuteri在乳制品中的應用及薏米產品的深入研發提供理論依據。