制備富含γ-氨基丁酸酸奶的乳酸菌篩選及相關特性分析

孫世鑫，李科，駱鵬飛，俞蘭秀，莫小葉，孫海燕，張麗君，劉冬

（1.深圳職業技術學院，深圳市發酵精制檢測系統重點實驗室，廣東深圳 518055）

（2.綠雪生物工程（深圳）有限公司，廣東深圳 518055）

γ-氨基丁酸，又名γ-氨酪酸、4-氨基丁酸，是一種在自然界廣泛存在的小分子量非蛋白質氨基酸。GABA是人體中樞神經系統中重要的抑制性神經遞質[1]，具有改善睡眠[2]、降低血壓[3]、緩解焦慮[4]和免疫調節[5]等多種生理功能。研究表明，健康人群體內產生的GABA 能夠滿足自身需要，但受到年齡增長或失眠、抑郁等亞健康狀態的影響，體內的GABA 會因為過度消耗導致含量明顯下降[6]。2009 年，我國將GABA納入新資源食品目錄。開發富含GABA 的功能性食品，能夠有效緩解和預防因體內GABA 減少而誘發的各種慢性疾病和亞健康癥狀，因而具備良好的市場前景。

目前，GABA 可通過化學合成[7]、天然植物提取[8]和微生物發酵等方法制備。但化學合成法的產物在安全性上存在爭議，尚不能應用于食品領域。天然物植物提取法受到原料、工藝等因素限制，提取分離產率低，不適用于工業化生產。相比之下，利用微生物如乳酸菌發酵，依靠其體內的谷氨酸脫羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD，EC4.1.1.15）將L-谷氨酸經α-脫羧反應生成GABA，具有合成速度快、生產成本低、發酵產量高等優點[9]，近年來被廣泛應用于富含GABA 的食品和藥品的合成[10]。

以酸奶為代表的發酵乳制品一直深受消費者歡迎，乳酸菌作為益生菌也被廣泛應用于酸奶生產中。但迄今為止，利用乳基底物培養食品安全級的產GABA 乳酸菌，并直接用于發酵生產富含GABA 的酸奶的研究報道鮮見，也尚未見到國內外有富含GABA的酸奶上市的報道。因此，篩選適宜在乳基底物中生長并具備高產GABA 能力的乳酸菌具有巨大的市場應用前景。

本研究從國內市售發酵食品中分離篩選具備合成GABA 能力的食品安全級乳酸菌，得到1 株在乳基底物中具備高產GABA 潛力的菌株，并對其菌株特性進行了初步研究，以期為富含GABA 的酸奶開發提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

本實驗選用國內市售奶酪、奶疙瘩和米糟等發酵食品作為菌種分離原料。

1.2 培養基

MRS 肉湯培養基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨10，牛肉粉5，酵母粉5，硫酸鎂0.1，醋酸鈉5，檸檬酸銨2，磷酸氫二鉀2，硫酸錳0.05，吐溫80 1 mL，調節pH 值為7.2±0.1，121 ℃滅菌15 min。

M17 肉湯培養基（g/L）：大豆胨5，肉胨2.5，酪胨2.5，酵母粉2.5，牛肉浸粉5，乳糖5，抗壞血酸0.5，甘油磷酸鈉19，硫酸鎂0.25，調節pH值為7.2±0.1，121 ℃滅菌15 min。

MRS 平板培養基：在MRS 肉湯培養基中添加瓊脂20 g/L。

MI7 平板培養基：在M17 肉湯培養基中添加瓊脂20 g/L。

乳基底物培養基：市售脫脂乳粉，純水溶解后配置成10%（m/V）的復原乳，添加L-谷氨酸鈉（L-Glu-Na）2 g/L[11]。

1.3 試劑

GABA（色譜純），Sigma 公司；四氫呋喃、甲醇、乙腈（色譜純），天津大茂化學試劑廠；L-Glu-Na（生化試劑純），國藥集團化學試劑有限公司；革蘭氏染色液試劑盒，北京陸橋技術股份有限公司；API 試劑盒，法國梅里埃公司；其他試劑均為國產分析純。

1.4 儀器與設備

5810R 型高速冷凍離心機，德國Eppendoff 公司；LC-20AT 型高效液相色譜，日本Shimadzu 公司；Spectra Max M2 型熒光酶標儀，美國Molecular Devices 公司；ECLIPSE TS100 型倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；PHS-3C 型pH 計，上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.5 方法

1.5.1 菌株的分離純化與培養

對原料進行前處理后，取樣品10 mL，用無菌生理鹽水梯度稀釋后涂布于MRS 平板培養基上，靜置于37 ℃和30 ℃培養箱中恒溫培養48 h，隨后挑選生長較快、肉眼可見的菌落在MRS 平板培養基上進行劃線培養，重復操作直至分離出形態一致的單菌落。對上述單菌落進行鏡檢、革蘭氏染色和過氧化氫酶實驗。將革蘭氏染色呈陽性、過氧化氫酶反應呈陰性的菌落純化后接種于適宜的肉湯培養基（乳桿菌-MRS培養基，乳球菌-M17 培養基）中靜置培養24 h。分別吸取等體積的菌懸液和40%（V/V）滅菌甘油于2 mL凍存管，搖勻，-80 ℃凍存。

1.5.2 分子生物學鑒定

16S rDNA 序列委托深圳華大基因科技有限公司測定。測序引物 27F 和 1492R 分別為：27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG，1492R TACGGYTA CCTTGTTACGACTT。PCR 反應體系（總體積30 μL）：無菌超純水17.8 μL，Buffer 3 μL，d NTP 2 μL，正向引物3 μL，反向引物3 μL，DNA 模板1 μL，酶0.2 μL。

PCR 反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，共循環35 次；最后72 ℃延伸10 min。將測序結果與NCBI 中Gene Bank 數據庫進行BLAST 對比，采用MEGA 7.0 構建系統發育樹。

1.5.3 產GABA 菌株的初篩和復篩

將菌株菌懸液以3%（V/V）體積分數接種于適宜的肉湯培養基（乳桿菌：MRS 肉湯培養基；乳球菌：M17 肉湯培養基）中，于該菌最適生長溫度下恒溫培養12 h，重復活化3 次。取單菌株種子液以3%（V/V）體積分數接種于適宜的肉湯培養基（同上）中，于最適生長溫度下恒溫培養72 h。取菌懸液1 mL 于4 ℃、12000 r/min 離心3 min，吸取適量上清液加入等體積5%（m/V）三氯乙酸溶液，再次于4 ℃、12000 r/min離心15 min。測定上清液中GABA 含量，并以其為指標初篩出具備合成GABA 能力的菌株。

從初篩的菌株中選擇產量相對較高的菌株，按初篩方法接種于乳基底物培養基，于最適生長溫度下恒溫發酵48 h，按初篩方法測定發酵乳中GABA 含量，并以其為指標復篩出具備高產GABA 能力的菌株。

1.5.4 GABA 的定量檢測

表1 梯度洗脫程序Table 1 The gradient elutionprogram

HPLC 法，在QB/T 4587-2013 檢測方法基礎上加以改進。精密吸取適量樣品液與等體積的鄰苯二甲醛衍生劑混合，室溫反應2 min 后經0.22 μm 尼龍針頭過濾器轉移至液相進樣瓶。流動相A 為25 mmol/L 醋酸鈉，調節pH 至7.2；流動相B 為甲醇和乙腈，混合比例為50:50，兩相均經0.45 μm 有機系濾膜抽濾后超聲脫氣20 min 后使用。色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為40 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL，檢測波長334 nm，梯度洗脫。

圖1 GABA 標準濃度曲線Fig.1 The standard curve of GABA

用質量濃度為10、50、100、150、250 μg/mL 的GABA 標準工作液并繪制標準曲線，如圖1 所示。以峰面積(y)對GABA 濃度(x)做線性回歸，得線性回歸方程y=14179x-59007，線性相關系數R2=0.9998。

1.5.5 菌株特性測定

1.5.5.1 形態學觀察

取菌液0.1 mL 涂布于平板培養基，在30 ℃下恒溫培養48 h，觀察、記錄菌落顏色、大小、邊緣生長情況。取少量經革蘭氏染色后用顯微鏡于100 倍油鏡觀察并拍照，記錄其菌體形態特征。

1.5.5.2 糖代謝特性分析

將菌株于30 ℃厭氧培養48 h 后，選取API 50 CH試驗條，按照試驗條的使用說明進行操作，對菌株的糖代謝特性進行分析。

1.5.5.3 生長曲線測定

比濁法[12]。將菌株接種于M17 肉湯培養基中，在30 ℃下恒溫培養48 h，以空白培養基作為對照，每隔2 h 使用酶標儀測定發酵液在600 nm 下的吸光度（即OD600值），并以時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制菌株生長曲線。

1.5.5.4 產酸曲線測定

pH 計法[13]。將菌株接種于M17 肉湯培養基中，在30 ℃下恒溫培養48 h，每隔4 h 測定發酵液pH 值，并以時間為橫坐標，pH 值為縱坐標，繪制菌株產酸曲線。

1.5.5.5 耐酸能力測定

將菌株分別接種于pH 值為2.0、3.0、4.0 的M17肉湯培養基中，在30 ℃下恒溫培養3 h，而后對不同pH 值培養基中的活性乳酸菌進行平板計數[14]，按式（1）計算菌株在不同pH 值下的存活率，測定菌株的耐酸能力。

1.5.5.6 耐膽鹽能力測定

菌株分別接種于膽鹽濃度為1.0、2.0、3.0 g/L 的肉湯培養基中，在30 ℃下恒溫培養3 h，而后對不同膽鹽濃度培養基中的活性乳酸菌進行平板計數[15]，按式（2）計算菌株在不同膽鹽濃度下的存活率，測定菌株的耐膽鹽能力。

1.5.5.7 自凝聚能力測定

取菌種菌懸液1 mL，在4 ℃下以4000 r/min 離心5 min，棄上清液，收集菌體，再用pH 值7.0 的磷酸鹽緩沖液重復洗滌菌體兩次，使菌體重懸于1 mL 磷酸鹽緩沖液中。分別測定在30 ℃下靜置2、4、24 h后上層懸液的OD600值，按式（3）計算菌株的自凝聚能力[16]。

式中：A0為t=0 時刻的OD600值；At為t 時刻的OD600值。

1.5.5.8 表面疏水性測定

取菌種菌懸液3 mL，在4 ℃下以4000 r/min 離心5 min，棄上清液，收集菌體，再用pH 值7.0 的磷酸鹽緩沖液重復洗滌菌體兩次，使菌體重懸于3 mL 磷酸鹽緩沖液中。分別吸取1 mL 的乙酸乙酯及1 mL 的氯仿與上述磷酸鹽緩沖液混合，室溫靜置分層15 min，測定水相的OD600值，按式（4）計算菌株的表面疏水性[17]。

式中：A0為溶劑萃取前水相t=0 時刻的OD600值；At為溶劑萃取后水相t=15 min 時刻的OD600值。

1.5.6 數據處理與分析

每次實驗均做3 次平行，數據結果以Mean±SD表示。實驗數據的差異顯著性用SPSS 22.0 軟件中one-way ANOVA 法檢驗，p＜0.05 視為有顯著差異，并用GraphPad Prism 8 軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

表2 菌株的種屬分類鑒定Table 2 Classification and identification of strains

從原料中共分離純化出菌株171 株，經深圳華大基因科技有限公司16S rDNA 測序并構建系統發育樹鑒定，全部為乳酸菌，鑒定結果見表2。所有待測菌株與對照菌株的同源性均在99%以上，其中基于一株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株構建的系統發育樹如圖2 所示。

2.2 具備高產GABA 能力菌株的篩選

利用改進后的HPLC法測定171株菌株發酵液中GABA 的質量濃度，對菌株進行初篩。得到具備GABA 合成能力的菌株74 株，其中乳桿菌2 種共41株，乳球菌3 種共33 株。經比較后發現，不同種屬的乳酸菌的GABA 合成能力存在顯著差異。初篩中GABA 產量高于0.01 g/L 的17 株乳酸菌及其產量如表3 所示。

圖2 基于一株乳酸乳球菌乳酸亞種菌株構建的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic treeconstructed based onstrain of Lactococcus lactis subsp. lactis

表3 初篩中具備較高GABA 合成能力的菌株Table 3 Strains with relatively high yield of GABA in preliminary screening

表4 復篩中菌株GABA 產量情況Table 4 GABA production of strainsin rescreening

從上表可以發現，短乳桿菌的GABA 合成能力相對突出。但目前短乳桿菌尚未列入我國《可用于食品的菌種名單》，不能滿足食品安全要求，故將短乳桿菌剔除。將剩余的12株乳酸菌轉接于乳基底物培養基中,于最適溫度下恒溫發酵48 h，并以發酵乳中GABA 含量為指標進行復篩，結果如表4 所示。

由上表可見，編號為4043 的乳酸乳球菌乳酸亞種菌株（以下簡稱4043 號菌株）在乳基底物中合成GABA 的能力最強，產量約為0.39 g/L。賢乾隆等[18]從酸菜和酸奶中分離得到干酪乳桿菌QL-20，按3%（V/V）接種至含L-Glu-Na 0.2%（m/V）的12%（m/V）的脫脂乳培養基中，37 ℃下靜置發酵，凝乳時間為6 h，發酵乳中GABA 產量約0.09 g/L。Nejati F 等[19]用添加了5 g/L 酵母膏和20 mmol/L 谷氨酸鈉的滅菌煉乳培養乳酸乳球菌 DIBCA1（Lactococcus lactisDIBCA1）和植物乳桿菌PU11（L. plantarumPU11），在37 ℃下復配發酵48 h，GABA 的產量超過了0.14 g/L。

表5 4043 號菌株API 50CH 試驗條代謝結果Table 5 Metabolism results of strain No. 4043 with API 50CH reagent strip

趙樹平等[20]從酸馬奶中篩選的瑞士乳桿菌ND01（L.helveticusND01），按3%（V/V）接種于11%（m/V）的滅菌復原乳中，于37 ℃下靜置發酵30 h，GABA產量最高近0.17 g/L。Wu QL 等[21]利用嗜熱鏈球菌YI-B1（Streptococcus thermophilusYI-B1）復配短乳桿菌NPS-QW-145（Lactobacillus brevisNPS-QW-145），于37 ℃下在添加2 g/L L-Glu-Na 的10%（m/V）脫脂乳中發酵24 h，GABA 的產量達到0.31 g/L。此外，閆天文等[22]將分離自內蒙古傳統發酵乳制品中的植物乳桿菌NDC75017（L. plantarumNDC75017）與德氏乳桿菌保加利亞亞種、嗜熱鏈球菌混合（L. P:L. b:S.t=0.5:0.5:1.5）作為發酵劑，當接種量為2%（V/V），L-Glu-Na 添加濃度為75 mmol/L，輔酶濃度為20 μmol/L，發酵溫度為43 ℃時，GABA 產量最高可達550 mg/kg。謝芳等[23]利用從生水牛乳中分離出的乳酸乳球菌乳酸亞種按照1:0.5:1 的比例復配德氏乳桿菌保加利亞亞種（1.2717Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（1.2718Streptococcus thermophilus），當乳酸乳球菌接種量為3%（V/V）時，在L-Glu-Na添加量為6‰（m/V）的脫脂水牛乳中37 ℃恒溫發酵，GABA 產量最高可達0.7 g/L。而薛玉清等[24]將從內蒙古傳統酸奶中篩選的植物乳桿菌與德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌按照0.5:0.5:1.5 的比例，總接種量為2%（V/V）接種至滅菌乳中，在43 ℃恒溫發酵3.6 h，GABA 產量超過了1.51 g/L?？梢?，未經發酵條件優化的4043 號菌株在乳基底物中單菌種發酵的GABA 產量明顯優于文獻報道的產量，但相較優化后的多菌種復配發酵的產量還有一定距離，后期可通過多菌種混合發酵及條件優化進一步提升自身GABA 產量。

2.3 4043 號菌株的菌株特性

2.3.1 形態學特性

4043 號菌株的平板菌落及菌株的鏡檢結果如圖3所示。由圖可知，菌落為半透明乳白色，呈不規則圓形，直徑在1 mm 左右，中央略微隆起，表面光滑濕潤，邊緣整齊。菌體呈球形或卵圓形。

圖3 4043 號菌株的菌落及菌體形態Fig.3 Colony and morphological characteristics of strain No.4043

2.3.2 糖代謝特性

采用API 50CH 試驗條對4043 號菌株的糖代謝特性進行測定，各底物試驗條代謝結果判別見表5。

可見，4043 號菌株可發酵葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、蔗糖和海藻糖等18 種單糖、二糖及多糖，不能代謝山梨糖、蜜二糖、山梨醇等31 種底物，后續在針對4043 號菌株開展的產品配方和發酵工藝優化過程中，應根據該菌種的糖代謝特征選擇合適的糖類。

2.3.3 菌株的生長和產酸曲線

4043 號菌株在30 ℃下恒溫培養48 h 的生長曲線和產酸曲線如圖4 所示。由圖4 OD600曲線可知，總菌數在接種后0～2 h 顯著增加，在2～8 h 內呈指數增加，8～12 h 緩慢增加并在13 h 附近到達峰值，隨后緩慢波動，自32 h 后開始顯著下降，直至發酵終點。這表明4043 號菌株適應期較短；對數生長期為接種后2～8 h，菌株繁殖迅速；8～32 h 為穩定期，能夠維持基本的生長能力；自32 h 后進入衰亡期。

圖4 4043 號菌株的生長及產酸曲線Fig.4 Growth and acid production curve of strain No.4043

由圖4 中pH 值曲線可知，4043 號菌株在適應期和對數生長期內產酸迅速，導致發酵液pH 值自7.2迅速降低至5.5 左右，但其后pH 值便穩定于此，直至發酵結束也未能進一步降低。這表明4043 號菌株的持續產酸能力較弱，容易導致發酵乳的凝乳形態不佳。此外有研究表明，對于乳酸乳球菌乳酸亞種而言，菌株GAD 的最適pH 值在4.7 左右[25]。較高的終點pH值也不利于自身GAD 活性的充分發揮，從而限制了GABA 產量的進一步增長。因此在應用于富含GABA的酸奶生產時，可復配具備較強持續產酸能力的菌種與4043 號菌株進行混合發酵，以進一步降低環境pH值，改善終點凝乳形態，提升GABA 產量。

2.3.4 菌株對酸和膽鹽的耐受性

能夠順利通過胃酸和膽鹽所構成的生物屏障，并穩定粘附于腸道上皮細胞從而實現定植，是益生菌在人體內發揮益生功能的前提條件[26]。因此，能夠在胃腸道中發揮作用的益生乳酸菌必須擁有較強的對酸和膽鹽的耐受性。4043 號菌株在不同pH 值和膽鹽濃度下的耐受情況如圖5 所示。由5a 圖可知，4043 號菌株對酸的耐受性隨pH 值變化差異顯著。于30 ℃下在pH 值為2.0 的M17 肉湯培養基中培養3 h 后，菌株存活率幾乎為零。隨著pH 值上升，4043 號菌株的存活率也顯著上升。當pH 值＞3 時，存活率明顯高于60%。結合其生長曲線和產酸曲線可知，在pH 值3～5.5 的條件下，4043 號菌株對酸具備較強的耐受性。由5b圖可知，當培養基中膽鹽濃度≥1 g/L 時，在30 ℃下靜置培養3 h 后，菌株基本無法存活，對膽鹽的耐受性極差。

圖5 4043 號菌株的耐酸和耐膽鹽特性Fig.5 Acid and bile salttolerance ability of strain No.4043

研究表明，健康人群胃腸道中，胃液pH 值和腸液膽鹽濃度都是動態變化的。在進食狀態下，胃部pH值在1.8～5.0之間波動，通常情況下維持在2.0左右[27]，而腸液膽鹽濃度在3～5 g/L 之間變化[28]。結合4043 號菌株對酸和膽鹽的耐受范圍可知，該菌無法在健康人群的胃腸道環境中存活，不適宜在胃腸道內定植以發揮益生菌功能，但仍可在發酵制備富含GABA 酸奶的過程中充分發揮其高產GABA 的潛力。

2.3.5 菌株的自凝聚能力和表面疏水性

研究顯示，自凝聚特性有助于乳酸菌形成生物膜，表面疏水性是決定乳酸菌非特異性粘附的重要動力，兩者對于乳酸菌向腸道上皮細胞的順利粘附和穩固定植至關重要[29]。4043 號菌株的自凝聚能力及表面疏水性如圖6 所示。從6a 圖可以發現，4043 號菌株的自凝聚力隨著時間延長呈非線性增加趨勢。在靜置2～4 h期間，4043 號菌株自凝聚力有所增加但差異不大，至24 h 后則迅速增加至72.77%，略優于夏海燕等[30]篩選的發酵乳桿菌18-2（70.50%）和17-1（70.67%）。

從6b 圖可以發現，4043 號菌株對乙酸乙酯的疏水性明顯高于對氯仿的疏水性，但兩者數值均低于8%。參照表6 可判定，4043 號菌株為弱疏水性菌株，粘附特性較差。雖然具備良好的自凝聚力，但低疏水性的菌體表面決定了4043 號菌株難以在人體腸道內實現有效粘附與定植。這再次印證，4043 號菌株不適宜在胃腸道內定植以發揮益生菌功能。

圖6 4043 號菌株的自凝聚能力和表面疏水性Fig.6 Auto-aggregationand hydrophobicity of strain No.4043

表6 菌株疏水性判定標準Table 6 Judgement standard of hydrophobicity

3 結論

3.1 本研究針對從市售發酵食品中分離出的171株乳酸菌，經肉湯培養基初篩和脫脂復原乳培養基復篩，最終得到一株在乳基底物中具有高產GABA 潛力的食品安全級乳酸乳球菌乳酸亞種菌株。將該菌以3%（V/V）接種于含L-Glu-Na 2 g/L 的10%（m/V）乳基底物培養基中，在30 ℃下單菌種發酵48 h，GABA產量約0.39 g/L。

3.2 所篩的乳酸乳球菌乳酸亞種菌株能夠代謝葡萄糖、半乳糖等18 種糖分。于30 ℃下接種于M17 培養基中，對數生長期為2～8 h。該菌持續產酸能力較弱，在pH 值3～5.5 的環境中具備良好的酸耐受性，菌株自凝聚力良好，但對膽鹽的耐受性極差，且屬于弱疏水性菌株，粘附特性較差，難以在人體腸道內有效粘附與定植，不適宜在胃腸道內定植以發揮其益生菌功能。

3.3 該菌種具有較高的產GABA 能力，可作為研制富含GABA 酸奶的潛力菌種應用于富含GABA 功能性酸奶的生產中。