甜葉菊苷M 的毒理學安全性評價

武新月，趙悅，施偉慶，陸羅定，陳耿，吳俊，俞萍

（江蘇省疾病預防控制中心，江蘇南京 210009）

甜葉菊（Stevia rebaudianaBertoni）俗稱甜菊、甜草[1]，原產于巴西南部和巴拉圭北部之間的阿曼拜山脈，是一種多年生的菊科草本植物[2]。已有的研究表明，甜葉菊具有顯著的抗炎、抗氧化、抗菌、抗糖尿病以及抗腫瘤等作用[3-7]。目前從甜葉菊中分離得到的成分主要有甜菊糖苷、三萜類、黃酮類、植物甾醇、揮發油和香豆素類等[8]，甜菊糖苷作為低熱量、無毒的天然甜味劑，甜度高出蔗糖300 倍，因此成為非熱糖替代品應用于食品、飲料、釀酒等生產工藝中[1,9]。甜菊糖苷是一類由多種甜味成分組成的四環二萜類化合物，包括甜菊苷、萊鮑迪苷A（rebaudioside A，reb A）、萊鮑迪苷B（rebaudioside B，reb B）、萊鮑迪苷C（rebaudioside C，reb C）、萊鮑迪苷E（rebaudioside E，reb E）、萊鮑迪苷F（rebaudioside F，reb F）、萊鮑迪苷M（rebaudioside M，reb M）、甜茶苷、杜克苷和甜菊雙糖苷等[10]。其中甜菊苷和reb A 作為甜菊糖苷的主要甜味成分，含量最高（約占85%），但其味道帶有強烈的苦澀，一定程度上限制了甜菊糖苷的應用[11]。相比之下，reb M 則甜度高，口感干凈，苦味大大降低，風味更加令人愉悅，但在甜菊糖苷中的含量極低（約占0.06%），因此作為甜味劑的開發和利用受到很大挑戰[12-14]。為了解決這一難題，研究者通過發酵和生物轉化的方法，使用基因工程改造的酵母菌將甜菊糖苷轉化成reb M，從而有效地提高reb M 的產量[15,16]。以甜菊糖苷為原料，在麥芽糖淀粉酶和葡萄糖淀粉酶以及畢赤酵母提取液的作用下充分反應，分離反應混合物，去除蛋白殘渣得到上層清液。然后將上層清液加入大孔樹脂進行吸附，接著用水沖洗樹脂柱，再用乙醇洗提數次，經濃縮、結晶、干燥后可得到reb M 及其同分異構體的混合物，稱為甜葉菊苷M（stevioside M）。目前對甜葉菊苷M 有限的研究中，主要是從化學結構、甜度和理化性質等方面進行的[17,18]，而對甜葉菊苷M 的毒理學安全性評價則尚未有報道。本研究按照國家衛生和計劃生育委員會發布的《食品安全性毒理學評價程序與方法》[19]，采用小鼠急性經口毒性試驗、Ames 試驗、小鼠骨髓紅細胞微核試驗、小鼠精母細胞染色體畸變試驗和28 d 經口毒性試驗對甜葉菊苷M 的毒理學安全性進行評價，為甜葉菊苷M 的進一步開發應用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

甜葉菊苷M：由無錫新和源生物制造有限公司提供。

1.1.2 主要試劑

鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102 和TA1535，美國Moltox 公司；S9，齊氏生物科技有限公司；敵克松，AccuStandard 公司；疊氮鈉，浙江東陽市天宇化工有限公司；2-氨基芴，Fluka AG 公司；1,8-二羥基蒽醌，SIGMA-ALDRICH 公司；環磷酰胺，Sigma 公司；絲裂霉素，浙江海正藥業股份有限公司；秋水仙素，國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 試驗動物

SPF 級健康ICR 雌、雄小鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司南京分公司提供，生產許可證號：SCXK（蘇）2016-0003 號；SPF 級健康SD 雌、雄大鼠，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產許可證號：SCXK（京）2016-0006 號。

1.1.4 儀器與設備

電子天平：PL203 型，梅特勒托利多儀器（上海）有限公司；生化培養箱：LRH-400 型，韶關市泰宏醫療器械有限公司；生物顯微鏡：OLYMPUS CX41RF型，日本日立公司；生化分析儀：OLYMPUS AU640型，日本日立公司；電解質分析儀：PSD-15b 型，南京攀事達電子儀器有限公司；血細胞分析儀：ADVIA 2120 型，德國西門子公司；全自動血凝儀：Coatron 1800 型，德國TECO 公司；尿分析儀：Scan 500 型，德國科寶公司；半自動石蠟切片機：RM 2245 型，德國萊卡公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠急性經口毒性試驗（限量法）

選取SPF 級健康ICR 小鼠20 只，雌雄各半，體重為18.5～21.3 g。給樣前禁食6 h。準確稱取樣品10000 mg 加純凈水至30 mL 攪拌成均勻的糊狀物，采取一次灌胃給予，灌胃容量為30 mL/kg·bw，劑量為10000 mg/ kg·bw。灌胃后連續觀察14 d，記錄中毒表現及死亡情況。

1.2.2 Ames 試驗

平板摻入法。使用菌株鑒定符合要求的鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97a、TA98、TA100、TA102 和TA1535。采用β-萘黃酮和苯巴比妥聯合誘導的大鼠肝S9作為體外代謝活化系統。準確稱取樣品1000 mg，加入DMSO 溶解定容至20 mL，經121 ℃，20 min 高壓滅菌。試驗設5 個劑量組，分別為5000、1000、200、40 和8 μg/皿，同時設自發回變組，溶劑對照組和陽性對照組。每個測試點做3 個平行皿，同樣實驗條件下測試兩次。

1.2.3 小鼠骨髓紅細胞微核試驗

SPF 級健康ICR 小鼠50 只，雌雄各半，隨機分為5 組，分別為6670、3330、1670 mg/kg·bw 三個劑量組，溶劑對照組（純凈水）和陽性對照組（環磷酰胺40 mg/kg·bw）。采用30 h 兩次灌胃法，每次灌胃容量為20 mL/kg·bw。于末次給藥后6 h 頸椎脫臼處死動物，取股骨骨髓于小牛血清中涂片、固定、染色。顯微鏡下，每只動物計數1000 個嗜多染紅細胞（PCE），記錄含微核的細胞數，并計算含微核細胞率；每只動物計數200 個嗜多染紅細胞，同時計數正染紅細胞（NCE），計算PCE 在總紅細胞中的比例。

1.2.4 小鼠精母細胞染色體畸變試驗

SPF 級健康雄性ICR 小鼠25 只，隨機分為5 組，分別為6670、3330、1670 mg/kg·bw 三個劑量組，溶劑對照組和陽性對照組。樣品各劑量組和溶劑對照組的灌胃容量為20 mL/kg·bw，每日灌胃1 次，連續5 d；陽性對照組僅于實驗第1 d 腹腔注射一次，注射量為10 mL/kg·bw。試驗第14 d 處死動物，取雙側附睪精子濾液制片鏡檢。顯微鏡下，每只動物計數500 個精母細胞，記錄染色體畸變細胞數，并計算畸變細胞率。

1.2.5 28 d 經口毒性試驗

SPF 級健康SD 大鼠，雌雄各40 只，隨機分為4組，分別為2000、1000、500 mg/kg·bw 三個樣品劑量組和基礎飼料對照組。采用逐步稀釋的方法將樣品摻入基礎飼料中，以每日約100 g/kg·bw 的攝食量給予大鼠自由食用，連續喂養28 d。每日觀察動物的一般表現，記錄中毒體征和死亡情況。每周稱量體重和進食量，計算食物利用率。試驗結束時采血進行血液學檢查、血清生化和電解質檢查。血液學檢查指標包括白細胞（WBC）、紅細胞（RBC）、血小板（PLT）計數、血紅蛋白（HGB）濃度、紅細胞壓積（HCT），中性粒細胞（NE）、淋巴細胞（LY）、單核細胞（MO）、嗜酸性粒細胞（EO）、嗜堿性粒細胞（BA）分類，凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）；血清生化檢查指標包括丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、谷氨酰轉肽酶（GGT）、堿性磷酸酶（ALP）、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖（GLU）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）；尿液檢測指標包括相對密度（SG）、pH 值、尿蛋白（PRO）、尿糖（GLU）和潛血（ERY）。采血后進行大體解剖檢查，并稱量心臟、胸腺、腎上腺、肝、腎、脾、睪丸、腦的絕對重量，計算臟/體比值；固定保存各組動物的臟器，先對高劑量組和對照組動物的腦、甲狀腺、胸腺、心臟、肝、腎、脾、腎上腺、胃、十二指腸、結腸、胰、腸系膜淋巴結、睪丸、卵巢、膀胱進行組織病理學檢查，若發現病變再對較低劑量組相應臟器及組織進行檢查。

1.3 數據分析

試驗所得數據以平均值±標準差表示，采用SPSS 18.0 統計軟件對數據進行統計分析。用泊松分布U 檢驗法對骨髓紅細胞微核試驗結果進行分析；用卡方檢驗對小鼠精母細胞染色體畸變試驗結果進行分析。

表1 甜葉菊苷M 對小鼠體重的影響Table 1 Effects of stevioside M on body weight in mice (±s)

表1 甜葉菊苷M 對小鼠體重的影響Table 1 Effects of stevioside M on body weight in mice (±s)

性別 動物數/只 劑量/(mg/kg·bw) 初始體重/g 第1 周體重/g 第2 周體重/g 死亡數/只 MTD/(mg/kg)雌 10 10000 19.91±0.77 23.38±1.21 27.00±1.64 0 ＞10000雄 10 10000 20.03±0.91 26.87±1.10 30.55±1.84 0 ＞10000

表2 Ames 試驗結果Table 2 Results of Ames test (n=3,±s)

表2 Ames 試驗結果Table 2 Results of Ames test (n=3,±s)

注：**表示超過溶劑對照2 倍以上。

測試次數 組別 TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535+S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9 +S9 -S9自發回變 122±9 115±8 33±4 32±3 120±6 144±7 295±7 287±24 14±4 13±5第1 次測試8 μg/皿 107±4 113±3 30±1 31±3 119±4 120±6 315±15 289±7 16±6 17±4 40 μg/皿 105±7 109±4 30±2 30±2 108±6 130±5 307±17 284±8 15±1 17±2 200 μg/皿 109±5 104±8 33±3 32±3 113±4 139±3 300±14 280±16 19±4 18±3 1000 μg/皿 106±11 106±3 33±3 32±3 110±4 139±4 314±9 286±8 16±4 15±4 5000 μg/皿 107±8 105±7 30±2 31±2 115±3 141±5 315±7 284±7 15±5 21±2溶劑對照 114±10 112±7 41±2 34±3 127±5 134±6 310±22 297±8 11±4 15±2陽性對照 1052±69** 1142±96** 896±35**769±99** 905±8** 922±107** 830±82** 888±40** 200±11** 418±32**第2 次測試自發回變 115±10 120±8 34±2 32±3 116±13 135±7 289±5 283±16 17±3 12±3 8 μg/皿 108±6 109±10 34±2 34±2 116±13 135±9 307±12 279±12 19±3 11±3 40 μg/皿 119±10 110±7 35±5 34±3 112±7 139±6 324±9 295±8 20±1 13±6 200 μg/皿 108±17 111±3 36±3 34±2 116±6 142±8 31320± 286±12 19±2 12±2 1000 μg/皿 117±3 110±8 38±2 35±3 117±3 146±6 314±11 283±16 17±1 13±4 5000 μg/皿 118±4 104±8 36±4 34±4 119±16 157±9 308±3 289±5 18±5 13±3溶劑對照 124±8 113±11 34±2 28±3 114±10 141±5 300±2 276±10 17±3 10±1陽性對照 940±65** 1143±110** 921±65**761±73** 910±24** 911±69** 892±92** 818±76** 250±76**533±62**

2 結果與分析

2.1 小鼠急性經口毒性試驗

小鼠灌胃后未見明顯中毒表現，觀察期內無動物死亡。觀察期結束后，大體解剖未見明顯異常。由表1 可見，甜葉菊苷M 對動物體重無明顯影響；本次試驗中樣品對雌雄小鼠急性經口MTD 值均大于10000 mg/kg b·wt（相當于估計最大攝入量的1312 倍），根據小鼠急性經口毒性分級標準，該樣品屬于實際無毒級。

2.2 Ames 試驗

劑量達5000 μg/皿各平板背景菌苔均生長良好。由表2 可見，在加與不加S9的情況下，兩次測試，樣品各劑量組五種菌株的回變菌落數均未達到空白對照組的2 倍，且無劑量-反應關系，而陽性對照組均表現出強烈的誘變作用。在本試驗條件下，甜葉菊苷M 對標準測試菌株TA97a、TA98、TA100、TA102 和TA1535不具有致突變作用，Ames 試驗結果為陰性。這一結果與文獻報道的rebA 的Ames 陰性[20]結果一致。

2.3 小鼠骨髓紅細胞微核試驗

由表3 可見，與溶劑對照組相比，樣品各劑量組含微核細胞率差異均無統計學意義（p＞0.05），也無劑量-反應關系；陽性對照組含微核細胞率與溶劑對照組相比差異具有統計學意義（p＜0.01）；樣品各劑量組動物PCE 占紅細胞總數的比例均高于對照組的20%。表明甜葉菊苷M 小鼠骨髓紅細胞微核試驗結果為陰性。

2.4 小鼠精母細胞染色體畸變試驗

由表4 可見，樣品各劑量組小鼠初級精母細胞染色體畸變細胞率與溶劑對照組相比，差異均無統計學意義（p＞0.05），也無劑量-反應關系；陽性對照組與溶劑對照組的染色體畸變細胞率、性染色體和常染色體單價體、斷裂和裂隙差異均具有統計學意義（p＜0.01，p＜0.05）。提示甜葉菊苷M 對小鼠初級精母細胞染色體無致畸變作用，試驗結果為陰性。

表3 小鼠骨髓紅細胞微核試驗結果Table 3 Results of micronucleus test in mice bone marrow (±s)

表3 小鼠骨髓紅細胞微核試驗結果Table 3 Results of micronucleus test in mice bone marrow (±s)

性別 組別 動物數/只 觀察細胞數/個 含微核細胞數/個 含微核細胞率 PCE 比例/%‰ p 值溶劑對照 5 10000 20 2.00±0.79 50.72 ±2.18雌性雄性1670 mg/kg 5 10000 18 1.80±0.76 ＞0.05 51.10±0.79 3330 mg/kg 5 10000 20 2.00±0.61 ＞0.05 51.24±1.35 6670 mg/kg 5 10000 21 2.10±1.24 ＞0.05 50.88±1.59陽性對照 5 10000 254 25.40±7.76 ＜0.01 49.36±2.35溶劑對照 5 10000 22 2.20±0.76 51.10±1.93 1670 mg/kg 5 10000 23 2.30±0.97 ＞0.05 50.82±2.15 3330 mg/kg 5 10000 20 2.00±0.79 ＞0.05 50.78±0.53 6670 mg/kg 5 10000 26 2.60±0.89 ＞0.05 50.45±1.80陽性對照 5 10000 274 27.40±5.52 ＜0.01 49.03±1.68

表4 小鼠精母細胞染色體畸變試驗結果Table 4 Results of chromosome aberration test in mice spermatocyte (±s)

表4 小鼠精母細胞染色體畸變試驗結果Table 4 Results of chromosome aberration test in mice spermatocyte (±s)

注：與陰性對照組相比，* p＜0.05；** p＜0.01。

組別 動物數/只觀察細胞數/個裂隙/個性染色體單價體/%常染色體單價體/%染色體畸變類型 畸變細胞數/個 畸變細胞率斷片/個 異位/個 微小體/個陰性對照 5 500 0 3.40±1.06 2.0±1.61 3 0 0 3 0.60±0.89 1670 mg/kg 5 500 0 3.20±1.26 1.80±1.26 4 0 0 4 0.80±0.84 3330 mg/kg 5 500 0 3.00±1.55 2.20±0.75 2 0 0 2 0.40±0.55 6670 mg/kg 5 500 0 3.20±1.09 2.00±1.15 4 0 0 4 0.80±0.84陽性對照 5 500 6* 8.20±1.26** 6.60±1.48** 42 4 0 46** 9.20±1.92**

表5 甜葉菊苷M 對大鼠體重的影響Table 5 Effects of stevioside M on body weight in rats (±s)

表5 甜葉菊苷M 對大鼠體重的影響Table 5 Effects of stevioside M on body weight in rats (±s)

性別 組別 動物數/只 初始體重/g 第1 周體重/g 第2 周體重/g 第3 周體重/g 第4 周體重/g 增重/g對照 10 76.20±4.34 125.60±4.17 167.40±13.23 195.40±15.86 220.30±18.53 144.10±16.29雌雄低劑量 10 76.10±3.60 123.90±6.85 162.10±7.39 189.00±12.26 213.60±17.40 138.00±15.84中劑量 10 75.70±2.83 126.80±3.91 170.30±11.91 198.30±15.28 224.60±16.30 149.08±15.41高劑量 10 76.10±3.25 125.50±4.93 168.60±8.04 194.40±8.57 221.70±11.24 146.36±11.01對照 10 86.30±4.69 150.00±8.57 212.20±14.23 271.00±19.44 325.10±28.23 238.80±28.83低劑量 10 86.30±6.67 149.00±7.56 216.60±15.82 277.50±19.82 339.40±24.64 253.10±19.40中劑量 10 86.70±5.72 149.30±6.06 213.80±13.87 272.30±18.07 328.70±21.43 242.00±18.41高劑量 10 87.10±5.28 150.60±9.85 215.00±11.16 274.80±13.54 333.90±17.10 246.80±15.35

表6 甜葉菊苷M 對大鼠每周攝食量及總攝食量的影響Table 6 Effects of stevioside M on weekly and total food intake in rats (±s)

表6 甜葉菊苷M 對大鼠每周攝食量及總攝食量的影響Table 6 Effects of stevioside M on weekly and total food intake in rats (±s)

性別 組別 動物數/只 第1 周攝食量/g 第2 周攝食量/g 第3 周攝食量/g 第4 周攝食量/g 總攝食量/g對照 10 113.50±7.44 146.00±9.96 149.20±8.40 171.20±16.09 579.90±33.73雌雄低劑量 10 114.60±6.19 137.40±7.29 144.40±10.37 163.10±17.82 559.60.±33.66中劑量 10 111.40±6.57 144.30±12.47 154.00±13.74 172.20±17.32 581.90±40.80高劑量 10 112.40±4.86 145.00±10.09 151.30±8.92 175.7±10.67 584.40±20.62對照 10 131.20±6.55 175.10±13.74 192.00±13.58 193.20±18.20 691.50±45.77低劑量 10 129.00±7.16 174.50±13.09 191.6±15.09 204.60±12.98 699.70±41.27中劑量 10 132.50±6.77 179.60±14.43 198.30±14.27 201.70±19.13 712.10±46.80高劑量 10 136.00±4.78 181.70±11.18 198.40±11.66 204.00±12.52 720.10±31.44

表7 甜葉菊苷M 對大鼠食物利用率的影響Table 7 Effects of stevioside M on food utilization rate in rats (±s)

表7 甜葉菊苷M 對大鼠食物利用率的影響Table 7 Effects of stevioside M on food utilization rate in rats (±s)

性別 組別 動物數/只 第1 周食物利用率/%第2 周食物利用率/%第3 周食物利用率/%第4 周食物利用率/%總食物利用率/%對照 10 43.72±3.76 28.42±5.54 18.81±2.95 14.47±2.78 24.83±2.06雌低劑量 10 41.75±3.88 27.89±3.50 18.60±4.39 14.87±2.75 24.55±2.26中劑量 10 45.88±2.27 29.84±5.44 18.10±3.04 15.27±2.10 25.55±1.35高劑量 10 43.91±2.67 29.72±2.50 17.16±2.45 15.44±3.62 24.91±1.64雄對照 10 48.96±4.84 35.30±4.33 30.59±3.00 27.86±2.97 34.48±2.98低劑量 10 48.67±1.97 38.63±3.05 31.81±2.48 30.29±2.71 36.16±1.53中劑量 10 47.34±2.90 35.93±4.58 29.50±1.63 28.08±3.01 34.02±2.04高劑量 10 46.70±4.70 35.41±2.79 30.17±2.82 29.01±3.46 34.29±1.88

2.5 28 d 經口毒性試驗

2.5.1 一般臨床觀察

試驗期間，各組動物的外觀、排便、進食及活動等均未見明顯異常，未見明顯中毒體征和死亡。這一研究與Nikiforov 等人進行的reb D 的28 d 喂養試驗結果一致[21]。

2.5.2 動物的體重及攝食情況

由表5～7 可見，與對照組相比，樣品各劑量組動物多個觀察點的體重、攝食量、食物利用率以及總的攝食量和食物利用率均無顯著性差異（p＞0.05）。

2.5.3 甜葉菊苷M 對大鼠血液學指標的影響

由表8 可見，與對照組相比，雌性大鼠低劑量組WBC 計數值偏高，NE 值偏低，差異有統計學意義（p＜0.05），但兩項指標值均在本實驗室歷史正常值范圍內，且無劑量-效應關系；雌性低、中劑量組和雄性低、中、高劑量組大鼠PT 值以及雄性低劑量組APTT值差異有統計學意義（p＜0.01，p＜0.05），但兩項指標變化均無劑量-效應關系，且雌雄動物變化趨勢不同，結合其他指標綜合分析認為，上述變化不具有生物學意義和毒理學意義；其余各劑量組的多項血常規指標與對照組相比無顯著性差異（p＞0.05）。

表8 甜葉菊苷M 對大鼠血液學指標的影響Table 8 Effects of stevioside M on hematological indexes in rats (±s)

表8 甜葉菊苷M 對大鼠血液學指標的影響Table 8 Effects of stevioside M on hematological indexes in rats (±s)

注：與對照組相比，* p＜0.05；** p＜0.01。

性別 組別 動物數/只 WBC/(109/L) RBC/(1012/L) HGB/(g/L) HCT/% PLT/(109/L) NE/%雌對照 10 6.37±1.08 6.66±0.31 120.30±5.27 37.15±1.49 1076.00±115.77 11.30±2.75低劑量 10 7.90±1.62* 6.65±0.36 121.30±6.53 36.94±2.22 1086.20±132.86 7.22±1.94*中劑量 10 7.51±1.65 6.76±0.30 122.10±7.25 37.19±2.14 1006.40±103.04 8.67±3.50高劑量 10 6.29±1.06 6.63±0.33 119.00±6.85 36.54±2.44 1164.20±119.77 9.15±3.52對照 10 7.12±1.26 6.73±0.35 127±8.51 38.99±3.02 1013.90± 99.16 10.25±1.84低劑量 10 8.55±1.57 7.00±0.27 124.60±5.60 40.05±1.54 1156.60±147.40 8.88±2.08中劑量 10 7.58±0.93 6.66±0.30 123.00±5.58 38.07±1.90 1094.40± 86.93 9.31±3.23高劑量 10 6.55±1.41 6.86±0.42 123.40±7.85 38.25±2.27 995.00±202.00 13.21±5.89性別 組別 動物數/只 LY/% MO/% EO/% BA/% PT/s APTT/s雄對照 10 84.19±3.55 2.77±1.13 1.15±0.49 0.13±0.07 21.90±1.62 11.67±1.49雌低劑量 10 88.89±2.69 2.17±0.67 0.96±0.43 0.18±0.08 17.90±0.73** 11.25±1.21中劑量 10 86.75±4.26 2.57±1.02 1.13±0.50 0.15±0.05 18.35±0.55** 11.93±1.63高劑量 10 86.85±4.03 2.29±0.63 0.91±0.30 0.15±0.10 23.15±1.65 11.82±1.30雄對照 10 85.42±2.33 2.75±0.76 1.20±0.72 0.16±0.05 22.08±1.42 10.63±2.21低劑量 10 88.23±2.64 1.97±0.68 0.59±0.20 0.16±0.05 25.85±3.04** 12.39±1.15*中劑量 10 87.30±4.09 2.14±0.98 0.84±0.66 0.15±0.07 24.40±1.31** 10.68±0.94高劑量 10 82.92±6.39 2.39±0.91 1.00±0.65 0.14±0.07 24.02±1.03** 10.74±0.82

表9 甜葉菊苷M 對大鼠血清生化指標的影響Table 9 Effects of stevioside M on serum biochemical indexs in rats (±s)

表9 甜葉菊苷M 對大鼠血清生化指標的影響Table 9 Effects of stevioside M on serum biochemical indexs in rats (±s)

注：與對照組相比，** p＜0.01。

性別 組別 動物數/只 ALT/(U/L) AST/(U/L) ALP/(U/L) GGT/(U/L) TP/(g/L) ALB/(g/L)對照 10 39.34±4.13 175.26±14.97 124.39±24.72 0.69±0.46 69.27±3.62 37.10±1.94雌低劑量 10 34.65±6.14 161.68±22.57 111.62±35.17 0.65±0.26 69.04±6.56 37.59±3.75中劑量 10 36.98±5.52 169.86±21.86 107.72±38.52 0.55±0.10 68.37±5.20 37.15±2.69高劑量 10 38.87±5.27 171.86±16.15 131.51±38.93 0.52±0.22 68.28±3.42 36.31±1.93對照 10 47.30±6.37 181.18±17.73 239.87±58.95 0.47±0.16 61.85±2.87 31.77±1.12低劑量 10 44.55±6.63 162.37±23.66 253.03±50.81 0.47±0.17 59.74±2.94 30.83±1.21中劑量 10 46.23±5.60 171.30±25.04 226.86±25.70 0.38±0.08 59.10±3.03 30.67±1.53高劑量 10 45.37±7.09 172.49±25.16 248.45±49.29 0.39±0.18 60.90±1.36 31.29±1.38性別 組別 動物數/只 GLU/(mmol/L) TG/(mmol/L) CHO/(mmol/L) BUN/(mmol/L) CRE/(mmol/L)雄對照 10 5.01±0.36 0.82±0.37 1.94±0.26 5.44±0.60 39.12±7.71雌雄低劑量 10 4.93±0.39 0.68±0.18 1.86±0.24 5.00±0.81 31.26±2.32**中劑量 10 5.18±0.35 0.64±0.14 1.87±0.51 5.41±0.65 35.73±4.07高劑量 10 4.90±0.53 0.77±0.30 1.93±0.44 5.12±0.40 38.52±4.30對照 10 5.03±0.82 1.09±0.43 1.87±0.20 5.19±0.52 29.71±3.20低劑量 10 5.47±0.45 0.83±0.26 1.63±0.32 4.52±0.89 27.08±2.90中劑量 10 4.96±0.53 0.76±0.19 1.59±0.19 4.59±0.73 28.56±3.15高劑量 10 5.01±0.44 0.82±0.21 1.70±0.30 4.20±0.49** 28.59±2.07

2.5.4 甜葉菊苷M 對大鼠血清生化指標和電解質濃度的影響

由表9～10 可見，與對照組相比，雌性大鼠低劑量組CRE 值偏低，雄性高劑組BUN 值偏低，差異均有統計學意義（p＜0.01），但這些指標值均在本實驗室歷史正常值范圍內，也無劑量-效應關系，其降低沒有毒理學意義；其余各項生化指標和電解質濃度值組間 差異均無統計學意義（p＞0.05）。

表10 甜葉菊苷M 對大鼠血清電解質濃度的影響Table 10 Effects of stevioside M on serum electrolyte concentration in rats (±s)

表10 甜葉菊苷M 對大鼠血清電解質濃度的影響Table 10 Effects of stevioside M on serum electrolyte concentration in rats (±s)

性別 組別 動物數/只 Na+/(mmol/L) K+/(mmol/L) Cl-/(mmol/L)對照 10 137.00±2.71 6.67±0.64 103.30±1.57雌雄低劑量 10 134.50±3.31 6.59±0.60 102.80±0.92中劑量 10 134.50±2.72 6.44±0.51 102.10±1.60高劑量 10 137.70±3.68 6.74±1.04 103.20±2.44對照 10 137.90±3.03 6.85±0.59 102.20±1.14低劑量 10 135.00±5.29 6.64±0.55 101.50±2.42中劑量 10 135.30±3.95 6.51±0.39 100.40±2.22高劑量 10 135.50±3.69 6.64±0.46 101.40±2.84

表11 甜葉菊苷M 對大鼠尿液指標的影響Table 11 Effects of stevioside M on urine indexs in rats (±s)

表11 甜葉菊苷M 對大鼠尿液指標的影響Table 11 Effects of stevioside M on urine indexs in rats (±s)

性別 組別 動物數/只 SG pH ERY/(P/N) PRO/(g/L) GLU/(P/N)對照 10 1.02±0.01 6.20±0.42 0/10 0.14±0.15 0/10雌低劑量 10 1.02±0.01 5.90±0.74 0/10 0.22±0.30 0/10中劑量 10 1.02±0.01 5.90±0.99 0/10 0.17±0.13 0/10高劑量 10 1.02±0.01 5.90±0.32 0/10 0.08±0.13 0/10雄對照 10 1.02±0.01 6.40±0.84 0/10 0.38±0.35 0/10低劑量 10 1.02±0.01 6.30±0.67 0/10 0.26±0.40 0/10中劑量 10 1.02±0.01 6.40±0.52 0/10 0.17±0.13 0/10高劑量 10 1.02±0.01 6.20±0.42 0/10 0.18±0.12 0/10

表12 甜葉菊苷M 對大鼠臟體比的影響Table 12 Effects of stevioside M on the organ-to body weight of rats (±s)

表12 甜葉菊苷M 對大鼠臟體比的影響Table 12 Effects of stevioside M on the organ-to body weight of rats (±s)

性別 組別 動物數/只 空腹體重/g 臟體比/%肝臟 腎臟 脾臟 心臟 胸腺 腎上腺 腦 睪丸對照 10 214.70±17.49 3.61±0.16 0.90±0.07 0.24±0.02 0.42±0.06 0.36±0.05 0.03±0.01 0.83±0.08 -雌雄低劑量 10 209.10±17.83 3.59±0.18 0.96±0.05 0.25±0.04 0.46±0.10 0.34±0.08 0.03±0.01 0.82±0.09 -中劑量 10 219.00±15.51 3.44±0.14 0.91±0.09 0.24±0.03 0.42±0.05 0.36±0.08 0.03±0.01 0.84±0.07 -高劑量 10 215.50±8.86 3.56±0.33 0.91±0.05 0.24±0.03 0.42±0.05 0.36±0.07 0.03±0.01 0.85±0.10 -對照 10 313.90±27.82 3.38±0.21 0.88±0.03 0.25±0.03 0.41±0.04 0.28±0.06 0.02±0.01 0.60±0.04 0.89±0.10低劑量 10 326.20±24.58 3.33±0.22 0.86±0.03 0.22±0.03 0.43±0.08 0.28±0.06 0.02±0.00 0.60±0.05 0.89±0.07中劑量 10 316.20±21.74 3.32±0.14 0.88±0.08 0.24±0.03 0.40±0.06 0.29±0.04 0.02±0.00 0.60±0.05 0.89±0.08高劑量 10 320.20±16.65 3.29±0.22 0.88±0.04 0.22±0.03 0.42±0.06 0.26±0.06 0.02±0.00 0.61±0.07 0.84±0.09

2.5.5 甜葉菊苷M 對大鼠尿液分析指標的影響

各劑量組大鼠尿液外觀無明顯異常。由表11 可見，各組雌雄大鼠尿液檢測指標與對照組相比，無統計學差異（p＞0.05）。

2.5.6 甜葉菊苷M 對大鼠臟體比的影響

與對照組相比，各劑量組大鼠肝、腎、脾、心臟、胸腺等臟器的臟體比均無統計學差異（p＞0.05），數據見表12。Nikiforov 等人的reb D 喂養大鼠的實驗中，測定器官重量與對照組無顯著差異[21]，與本試驗結果一致。由此說明甜葉菊苷M 對大鼠臟體比沒有明顯影響。

2.5.7 組織病理學檢查

對所有動物進行大體解剖檢查，均未發現明顯異常。因此，先選擇高劑量組和對照組動物的腦、甲狀腺、胸腺、心臟、肝、腎、脾、腎上腺、胃、十二指腸、結腸、胰、腸系膜淋巴結、睪丸、卵巢、膀胱進行組織病理學檢查。與對照組相比，高劑量組大鼠各受檢臟器均未出現與甜葉菊苷M 明顯有關的特異性組織病理學改變，故未進行其他劑量組動物臟器的組織病理學檢查。

3 結論

基于甜菊糖苷現有的研究結果，歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）和糧農組織/世衛組織食品添加劑聯合專家委員會（Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives，JECFA）建立了甜菊糖苷的每日允許攝入量（acceptable daily intake，ADI），即4 mg/kg·bw 甜菊醇當量[22,23]。由于各種甜菊糖苷具有相同的代謝產物甜菊醇，因此ADI 值適用于所有的甜菊糖苷[24]。按照文獻報道的方法，假設由reb M 構成整個甜味劑市場（這一估計非常保守），那么對于一般健康成人人群，reb M 估計最大攝入量為5.19 mg/kg·bw，相當于1.28mg/kg·bw 甜菊醇當量；健康兒童的估計最大攝入量為7.62 mg/ kg·bw，相當于1.88 mg/kg·bw 甜菊醇當量[25]。若以甜菊醇當量表示，則reb M 的估計最大攝入量遠低于EFSA 和JECFA 建立的ADI 值。在本次試驗中，甜葉菊苷M 對雌雄小鼠急性經口MTD 值均大于10000 mg/kg·bw，相當于估計最大攝入量的1312倍，因此屬于實際無毒級。Ames 試驗、小鼠骨髓紅細胞微核試驗和小鼠精母細胞染色體畸變試驗均為陰性，表明樣品無遺傳毒性。28 d 經口毒性試驗發現，劑量達到2000 mg/kg·bw 時，樣品對大鼠的體重、攝食量、食物利用率、血液學、血生化和組織病理學等均未產生明顯影響，提示樣品不具有短期毒性。在本試驗設定的條件下，根據高劑量組動物實際攝入樣品的劑量計算，該樣品對雌、雄大鼠28 d 經口毒性NOAEL 值分別為2650 和2421 mg/kg·bw。本次試驗初步評價了甜葉菊苷M 的安全性，并為下一步較長期毒性和慢性毒性試驗劑量、觀察指標、毒性終點的選擇提供依據。由于動物和人存在物種差異，試驗結果外推到人有一定的局限性，但可為初步估計人群允許接觸水平提供有價值的信息。