基于HPLC 指紋圖譜鑒別四個不同品種的金銀花葉

童凱，沈國強，黃月，李潔媛，曾繁富，閆蒙，甘婉瑩，李東

（1.四川輕化工大學生物工程學院，四川宜賓 644000）

（2.釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川宜賓 644000）

金銀花一般指忍冬科忍冬屬植物忍冬（Lonicera japonicaThunb.），是一種重要的藥食兩用物質，其花、莖、葉均具有較高的醫療和食用價值。在中醫實踐中，常用金銀花的花蕾和藤莖治療風熱感冒、溫病發熱等癥候，在食品行業中，常用金銀花的花蕾或花朵生產植物飲料或代用茶[1]。金銀花的葉因產量相對較高，富含綠原酸、黃酮等活性物質，且具有抑菌、抗氧化等藥理作用，在許多功能性食品、中成藥、動物飼料、化妝品、日化品中均具有廣泛的應用[2,3]。

我國金銀花及其近緣種的遺傳資源十分豐富，有忍冬屬植物98 種，5 亞種，18 變種[4]?，F流通于市的常見近緣種主要包括灰氈毛忍冬L. macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬L. hypoglaucaMiq.、華南忍冬L. confuseDC.、黃褐毛忍冬L. fulvotomentosaHsu et S.C. Cheng，該4 種近緣種也可被統稱為“山銀花”[5]。此外，在長期的人工栽培歷史中，逐漸形成了毛花系列、雞爪花系列、野生系列等一系列金銀花栽培品種。前人研究表明，不同種質來源的金銀花，在農藝性狀、營養風味、藥理活性、經濟價值等方面具有顯著的差異，一旦誤用或混用則可能導致嚴重的后果[6-9]。因此，準確鑒別金銀花的種質來源，是金銀花種植、加工、流通、消費等各環節，保障金銀花產品品質和安全的重要內容。

現已開發的各類鑒別技術具有各自不同的適用條件，在實際工作中需要根據具體情況靈活使用[10,11]。例如，基于原植物形態特征的鑒別方法，具有簡便易行的優點，尤其適用于野外鑒別，但對鑒別者的專業水平和經驗依賴較強，而且對于局部樣、破損樣、粉末樣等往往難于做出準確鑒定?；谥参顳NA 序列特征的分子鑒別方法，具有專屬性強的特點，尤其適用于精準鑒別，但因靈敏度過高，可能對極少量的、無意引入的異種DNA 污染造成誤判[12]。近年來，基于樣品內在化學物質群的組成和含量特征建立的化學指紋圖譜技術，由于在準確度和靈敏度方面具有較好的平衡，已在咖啡[13]、陳皮[14]、橄欖油[15]等眾多產品的質量評價和真偽鑒別中得到成功應用，表現出廣闊的潛力。

本研究以4 種不同種質來源的金銀花葉為研究材料，利用高效液相色譜儀（HPLC）建立化學指紋圖譜，結合主成分分析、聚類分析等多變量統計分析方法，比較分析4 種金銀花葉的化學物質群差異，以期為不同種質金銀花的鑒別及其產品的質量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

供試金銀花葉于2019 年11 月采集自四川省雅安市天全縣，經植物學形態考察初步鑒定，來自于4 個不同的種質資源，分別為忍冬栽培品種“北花1 號”（Bei Hua 1,L.japonicaThunb.）、忍冬栽培品種“四季金銀花”（Si Ji,L. japonicaThunb.）、紅腺忍冬(L.hypoglaucaMiq.)和灰氈毛忍冬（L. macranthoidesHand.-Mazz.）。每個種質類型采集8 批次樣品，依次編號為B1-B8，S1-S8，H1-H8 和Y1-Y8，每批次樣品由相同種質的不同植株的葉片混合構成，合計采集32批樣品。

圖1 供試金銀花原植物Fig.1 Honeysuckle plants from 4 different genetic varieties

1.1.2 主要設備

Agilent 1260 高效液相色譜儀，美國安捷倫科技公司；KQ-700DE 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；101-3B 電熱恒溫干燥箱，浙江力辰儀器科技有限公司；101-3AB 高速中藥粉碎機，溫州頂歷醫療器械有限公司；UPT-1-100L 超純水器，成都超純科技有限公司。

1.1.3 主要試劑

色譜級乙腈、甲醇、甲酸，購自于賽默飛世爾科技（中國）有限公司；無水乙醇，購自于成都科隆化學品有限公司；超純水由超純水儀提供；綠原酸標準品（純度＞98%），購自于成都德思特生物技術有限公司，生產批號為DST190906-021。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

選擇各批次樣品中無病斑和蟲眼的新鮮健康葉片，除去泥塵、雜質，在105 ℃下殺青5 min 后，于60 ℃恒溫干燥約4 h，粉碎過60 目篩，低溫避光保存備用。

1.2.2 溶液制備

精密稱量0.5 g 樣品粉末，加入20 mL 50%乙醇溶液，稱定重量。40 kHz 下超聲提取30 min，期間震蕩兩次。靜置冷卻到室溫后再次稱重，用50%乙醇溶液彌補損失的重量。靜置30 min 后，取上清液1 mL，過0.45 μm 微孔濾膜，取濾液低溫保存備用。另精密稱取適量標準品，用50%甲醇（色譜級）溶解后，低溫保存備用。

1.2.3 色譜條件

在陳魁霞等[16]研究的基礎上略作修改，采用如下色譜條件：色譜柱：Infinity Lab Poroshell 120 EC C18柱（150 mm×4.6 mm）；流動相（A：0.1%甲酸，B：甲醇，C：乙腈）；流速：0.5 mL/min；檢測柱溫：30 ℃；檢測時間：40 min；檢測波長：327 nm；梯度洗脫程序：0～36 min，流動相A：90%～67%，流動相B：0%～3%，流動相C：10%～30%；36～40 min，流動相A：67%～10%，流動相B：3%～10%，流動相C：30%～80%。

1.2.4 數據分析

采用Open LAB Chemstation 化學工作站提取色譜數據，采用Microsoft Excel 進行數據預處理，采用MetaboAnalyst 4.0 軟件進行聚類分析和主成分分析。

2 結果與討論

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜檢測與數據提取

圖2 不同種質金銀花葉典型指紋圖譜Fig.2 Typical HPLC fingerprint of different honeysuckle leaves

32 批次樣品溶液按1.2.3 所述色譜條件連續進樣測定，得到相應的HPLC 色譜圖。4 種不同種質來源的金銀花葉典型HPLC 色譜圖見圖2。各個色譜圖可在0～40 min 內基本出峰完畢，且出峰數量豐富，峰形良好，從中提取出特征色譜峰34 個，按照保留時間先后順序，依次編號1～34。同時記錄各色譜峰的峰面積數據，組成32×34 的分析數據集。

2.1.2 色譜峰指認

根據《中國藥典》（2015 版），金銀花以綠原酸和木犀草苷作為其質量評價的指標成分。因此，在相同色譜條件下，分別進樣測定綠原酸和木犀草苷標準品溶液，記錄其保留時間并與樣品溶液色譜圖比對。結果顯示，本實驗色譜圖中第7 號色譜峰為綠原酸的物質信號（圖3），而木犀草苷在該色譜條件下未被檢出。

圖3 色譜峰指認結果Fig.3 Result of chromatographic peak identification

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗

以綠原酸標準品作為內標溶液，連續進樣6 次，記錄并計算其色譜峰面積相對標準偏差RSD 值，為3.02%，變異幅度較小，說明所建立的色譜方法精密度較好。

2.2.2 穩定性試驗

制備混合葉片樣品，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h 后進行測定，記錄并計算綠原酸色譜峰面積相對標準偏差RSD 值，為4.78%，變異幅度較小，說明所建立的色譜方法穩定性較好。

2.2.3 重現性試驗

平行制備5 份四季金銀花樣品溶液，依次進樣測定，記錄并計算7 號峰（綠原酸）的色譜峰面積相對標準偏差RSD 值，為1.55%，變異幅度較小，說明所建立的色譜方法重現性較好。

2.3 主成分分析

主成分分析（PCA）是一種降維技術，其基本思想是用少數幾個具有代表性的綜合指標（主成分）代替多個原始變量，從而實現降維觀察數據特征的多元統計分析方法[17,18]。例如，宋九華[19]等人針對不同產地金銀花樣品構建了HPLC 指紋圖譜，然后利用主成分分析方法，對圖譜中13 個共有峰面積所構成的數據集進行降維比較后發現，產自于四川、山東、貴州、安徽、河南等不同產地的16 批次金銀花可以分為3個大產區，為金銀花的產地識別和質量控制提供了有益的方法參考。

本研究以32 個不同品種來源的金銀花葉為對象構建HPLC 指紋圖譜，對從中提取的34 個色譜峰的峰面積組成的數據矩陣進行主成分分析。結果顯示，前兩個主成分（PC1 和PC2）分別表征了原始變量35.1%和16.2%的變異信息。在以PC1 和PC2 為橫縱坐標繪制的二維得分圖中，32 個供試樣品的分布呈現4 種明顯不同的聚集趨勢，來自于相同品種的樣本傾向于聚集為相同一組，而不同品種的樣品則相互遠離。尤其，在PC1 方向上，8 個灰氈毛忍冬樣品（Y1-Y8）與其他3 種樣品均相距較遠。以上結果說明，4 種不同品種來源的金銀花葉的總體化學物質群具有顯著差異，通過主成分分析可以對不同品種來源的金銀花葉取得較好的區分效果，這為實際應用中區別使用不同品種的金銀花原料，以及相關產品的質量控制提供了參考依據。類似的，Qingxia Wang[20]等人從植物學形態、ITS 序列、花蕾中活性成分積累等方面，詳細比較了忍冬、灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、紅腺忍冬等4種不同品種的金銀花的差異，結果發現正品金銀花（L.japonicaThunb.）與其他3 種易混淆金銀花品種均具有較大差異，這與本研究的結果是一致的。

圖4 主成分分析得分圖Fig.4 Score plot of PCA

圖5 聚類分析結果Fig.5 Result of cluster analysis

2.4 聚類分析

系統聚類法的基本思想是將多個樣品各自作為一類，然后計算各類之間距離的遠近，首先將距離最近的兩類合并成新的一類，然后用所得到的新的一類和其他類的樣品再進行距離分析，將此時距離最近的再歸為一類，直至將所有樣品合為一大類，最終形成聚類樹狀圖[21,22]。邵林[23]等人利用聚類分析的方法，對山東地區10 個不同栽培品種金銀花花蕾的HPLC 指紋圖譜進行分析，發現金銀花花蕾的化學物質群特征，不僅在植物物種之間，也包括在不同栽培品種之間仍然具有較大差異。本研究利用系統聚類的方法，以歐氏距離為度量，對32 個樣品進行聚類分析。結果顯示，32 個樣品中所有供試的灰氈毛忍冬樣本首先被單獨聚為一類（圖5，組1），提示其化學物質群特征最大程度區別于其他3 個品種的樣品（圖5，組2），這與上述主成分分析的結果是一致的。繼續聚類分析顯示，8 個紅腺忍冬的樣本可再繼續被單獨聚為一類（圖5，組2-1），以區別于“北花1 號”和四季金銀花的樣本（圖5，組2-2）。值得注意的是，“北花1 號”和四季金銀花雖同為忍冬植物的不同栽培品種，但仍然具有相對穩定和特殊的內在化學物質群，在聚類分析時還可繼續被各自聚為一類（圖5，組2-2a 和組2-2b），這與上述邵林[23]等人的研究結果是類似的。在本研究中，相較于四季金銀花，其他品種中與之具有相似化學特征的金銀花品種依次為“北花1 號”，紅腺忍冬和灰氈毛忍冬。這提示金銀花葉的化學物質群差異，反映了各品種之間的親緣關系強弱，并可據此建立HPLC 指紋圖譜用以輔助不同品種的鑒別分析。

進一步地，對各色譜峰面積在各種質之間的差異進行方差分析，根據P 值大小取前10 個最顯著差異的色譜峰，并按峰面積相對大小值繪制熱力圖（圖5）。結果顯示，指紋圖譜中第16 號、24 號、18 號、14 號、6 號、29 號、8 號、5 號、7 號、11 號色譜峰是各種質金銀花葉化學差異的最主要來源。其中，7 號峰經指認為綠原酸，其相對含量按高低依次為灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、北花1 號和四季金銀花。這與肖作為[24]等人關于金銀花和山銀花中綠原酸含量的定量測定結果是吻合的。其他具有顯著差異的色譜峰，經質譜檢測等方法進一步鑒定后，可開發作為穩定的化學標記，用以輔助金銀花不同種質之間的鑒別分析。朱姮[25]等人利用RRLC-DAD-ESI-Q-TOF-MS 技術建立了山東金銀花花蕾的多指標定量指紋圖譜，從中準確鑒定了32 種化學成分，并且實現了不同品種金銀花和湖南山銀花的正確區分。而關于金銀花葉片的化學成分構成，前人的相關研究表明，綠原酸、木犀草苷、蘆丁等酚酸類、環烯醚萜苷類、黃酮類物質是金銀花葉發揮抑菌、抗病毒、抗氧化、抗血小板聚集等藥理活性的主要物質基礎[26]。陳魁霞[16]等人建立了金銀花中10 種酚酸類成分的HPLC 同時測定方法，趙金娟[27]等人測定了不同品種金銀花的花和葉中活性成分含量，發現金銀花的葉中木犀草苷含量高于花，且不同品種之間存在顯著差異。這些研究為金銀花葉的化學鑒別和開發利用研究提供了良好的方法和思路參考。

3 結論

本研究所建立的HPLC 指紋圖譜，揭示了灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、“北花1 號”、四季金銀花4 種不同種質的金銀花葉具有顯著不同的化學物質群特征。指紋圖譜中第5、6、7（綠原酸）、8、11、14、16、18、24、29 號色譜峰是各個種質金銀花葉化學差異的主要來源，結合主成分分析和聚類分析，可實現對金銀花不同種質之間的鑒別分析。