雄性生殖系統中瘦素表達及功能的研究進展

金明昊，黃文一，張夢旖，張一葦，劉悅，丁之德

瘦素（leptin）是一種蛋白質類激素，主要由脂肪組織分泌，也可由腦垂體前葉、精子等非脂肪組織或細胞分泌。早在1995年，瘦素因其對能量平衡和體質量的調節功能而被發現[1]。2004年起，學者們陸續發現瘦素能促進和刺激下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸發育[2-4]。近期研究證明瘦素在雄性哺乳動物HPG軸內分泌器官、睪丸、生殖道、附屬生殖腺及精子中的水平異?？蓪е滦坌陨诚到y的發育和功能障礙。我國近年來的臨床研究結果顯示，健康男性精漿中瘦素濃度約為0.8～1.5 μg/L，血清瘦素濃度低于10 μg/L。肥胖相關的男性不育患者精漿和血清中瘦素濃度差別較大，但兩者均顯著高于健康男性[5-6]。

1 瘦素的定義、結構及生物學功能

1.1 瘦素及其受體基因和蛋白結構 瘦素是由肥胖基因（ob）編碼且主要由脂肪組織分泌的一種細胞因子。人類ob基因定位于染色體7q32.1，跨度約20 kb，并且僅有一個拷貝。ob基因在脊椎動物中高度保守，人和小鼠的總編碼序列84%同源。瘦素蛋白是由146 個氨基酸殘基構成的單鏈多肽，分子質量約16 ku，由4個反向平行的α螺旋（A、B、C、D）構成，其中有2個保守的半胱氨酸殘基構成二硫鍵，對其結構穩定和生物活性至關重要[1]。

瘦素受體（LepR）是由糖尿病基因（db）編碼，含1 165個氨基酸的細胞因子受體。db基因位于染色體1p31.3，其轉錄產物有多種拼接形式，分別翻譯不同的LepR。LepR有6種亞型（LepRa～f），根據其有無胞質結構域和跨膜結構域可分為分泌型（既無胞質結構域也無跨膜結構域）、短型（無胞質結構域、有跨膜結構域）、長型（有胞質結構域和跨膜結構域）3類。其中LepRe為分泌型；LepRa、LepRc、LepRd和LepRf為短型，包含box1模體（胞內氨基酸6～17位），能夠結合Janus激酶（Janus kinase，JAK），并激活其他一些信號轉導的級聯反應；LepRb為長型，含有JAK-信號傳導與轉錄激活因子（signal transducers and activators of transcription，STAT）結合位點，能將激活信號完全導入含受體的靶細胞[7]。

1.2 瘦素的生物學功能 瘦素在外周組織中具有多樣生物活性，最早因其在肥胖和能量代謝方面具有重要作用而受到關注。瘦素可以降低動物食欲，提高能量代謝效率。瘦素及其受體基因突變可引起機體脂肪代謝障礙和內分泌缺陷，從而導致肥胖[8]。另一方面，瘦素可上調多種炎性細胞因子的分泌，包括腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、IL-12。在非自身免疫炎癥性疾病如心血管疾病、代謝性疾病中，瘦素低表達可抑制免疫系統產生不利影響，而在自身免疫性疾病中瘦素低表達可降低過激免疫反應，減緩慢性炎癥的進展[9]。此外，瘦素在雄性生殖中同樣發揮重要作用。

2 瘦素及其受體在內分泌及雄性生殖系統的表達

血循環中的瘦素主要由皮下的白色脂肪組織產生和分泌，也可由一些非脂肪組織產生，如腦垂體前葉；也有研究發現人射出的精子中有瘦素分泌[10]。瘦素通過與其受體結合發揮作用。不同亞型的受體在人體內分布廣泛，其中與男性生殖有關的主要分布在HPG軸[11-12]、睪丸Sertoli細胞[13]和Leydig細胞[14]。

2.1 瘦素及其受體在HPG軸中表達 LepR在哺乳動物下丘腦多種神經元和內分泌細胞中廣泛分布，尤其是在下丘腦弓形核（ARC）中高表達，瘦素經血循環至大腦并作用于此處的LepR，參與能量代謝的調節[15]。然而，在HPG軸調控生殖起始環節的促性腺激素釋放激素（GnRH） 神經元中卻無法檢測到LepR；同時，也無法檢測到LepR作用最重要的下游靶點磷酸化STAT3（p-STAT3）[11]。

LepR在GnRH神經元的上游神經細胞中有較多表達，如腹側前乳核（PMV）神經元[16]、弓形核親吻肽（Kisspeptin）神經元[17]以及GABA能神經元[18]，這些實驗結果為了解瘦素對GnRH神經元的可能性作用機制提供了重要的研究方向。

垂體結節部近90%的促性腺激素細胞和遠側部30%的促性腺激素細胞有LepR表達。實驗表明，垂體促性腺激素細胞在GnRH、神經肽Y、生長激素釋放激素（GHRH）的刺激下會局部分泌瘦素[12]。

2.2 瘦素及其受體在睪丸與附睪中表達 小鼠睪丸組織中，瘦素及其受體主要表達于生精小管和睪丸間質[11]。在生精小管，LepR定位于生精細胞。在新生小鼠體內，小鼠睪丸中瘦素及其受體的表達部位隨著小鼠睪丸的發育而發生變化：5日齡小鼠瘦素表達局限于原始生殖細胞（PGC），LepR表達于A型精原細胞；10日齡以上小鼠瘦素及其受體表達于A型和B型精原細胞。在成年小鼠體內，瘦素在生精上皮周期的第Ⅶ至第Ⅻ期表達于精母細胞，而LepR在生精上皮周期的第Ⅸ和第Ⅹ期表達于精母細胞，呈現明顯的生精上皮周期特異性[19-20]。

大鼠附睪中，瘦素及其受體僅表達于亮細胞（clear cell），且實驗結果顯示：在蛋白水平上，瘦素及其受體在附睪頭部區域表達較多，而在mRNA水平上，瘦素和其受體在附睪尾部區域表達較多[21]。

2.3 瘦素及其受體在附屬腺中表達 人前列腺和精囊腺上皮的分泌細胞中存在瘦素和LepRb，提示精囊腺和前列腺可能是精液中瘦素的重要來源之一。LepR在前列腺中有較高的表達，血清中高濃度瘦素可以促進前列腺癌細胞增殖[22]。Malendowicz等[23]發現大鼠瘦素mRNA表達量在精囊腺和前列腺后葉（dorsal lobe）中較高，且各類型LepR在不同前列腺葉中含量各異。

2.4 瘦素及其受體在精子及精漿中表達 精漿中存在瘦素和游離型LepR。人精液中的瘦素至少有2種變體，以游離形式存在[24]。Jope等[25]在人精子中檢測到一個LepR亞型（145 ku），該亞型可能是瘦素作用于精子的靶點，通過免疫熒光顯微鏡觀測到其定位于精子尾部。該受體的暴露與精子膜完整性密切相關，推測精子膜完整性丟失可能會增加LepR的表達。

3 瘦素在雄性生殖中的功能及意義

瘦素在雄性生殖中發揮重要作用。肥胖伴隨高血清瘦素水平與精子數量減少、活力下降、DNA碎片增加等密切相關[2]。瘦素基因敲除的雄性小鼠（ob/ob小鼠）均喪失生育能力[3]，其睪丸體積變小并伴有組織形態和生化指標的異常[4]。同時，還有研究認為血清瘦素水平與性成熟有關[26]。

3.1 瘦素通過HPG軸調節生殖系統功能 瘦素可通過HPG軸調控性腺功能。HPG軸是哺乳動物體內通過神經-內分泌系統調控性腺功能的主要途徑，在促進性成熟和維持性功能方面起著重要作用。下丘腦是HPG軸的起始環節，下丘腦視前區的GnRH神經元接受相應刺激后會釋放GnRH作用于垂體，垂體釋放黃體生成激素（LH）和卵泡刺激素（FSH），LH和FSH可分別促進睪丸Leydig細胞合成分泌睪酮以及生精小管中的精子發生[27]。

3.1.1 瘦素作用于下丘腦 禁食期大鼠血清脂肪源性瘦素水平低下時，GnRH和LH分泌量均減少并可引起不育[28]。先天性瘦素缺乏癥患者也存在促性腺激素水平低下導致的性腺功能減退[29]。STAT蛋白家族是一組可被不同的細胞因子受體激活的相關蛋白，其中STAT3可以被LepR激活且磷酸化形成p-STAT3。然而，GnRH神經元中并不能檢測到瘦素誘導的p-STAT3，也無法在GnRH神經元中檢測到LepR。另外，GnRH細胞LepRb基因缺失也未導致小鼠生殖功能的缺陷[30-31]，因此，這些實驗結果表明瘦素并不直接作用于GnRH神經元。

下丘腦的PMV中存在LepR的集中表達。實驗發現瘦素干預后，高比例的PMV神經元去極化，這與瘦素作用于下丘腦視前區ARC的機制相似，該過程同樣依賴于磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）。去極化的PMV神經元直接向GnRH細胞傳遞信號，這表明在瘦素信號轉導至HPG軸過程中，PMV神經元可能具有重要的中間傳遞作用[16]。

Kisspeptin是已知最有效的GnRH釋放誘導因子，瘦素很可能通過調節Kisspeptin分泌系統中的基因和蛋白表達，間接調節GnRH的釋放。下丘腦中的Kisspeptin合成細胞主要位于ARC與前房室周圍核（AVPV），然而這些區域中僅有極少Kisspeptin合成細胞能夠表達LepR，這表明瘦素還可能通過某種間接途徑調控Kisspeptin系統[17]。

以一氧化氮（NO）為代表的氮能系統（nitrergic system）是瘦素調節中樞神經的重要中間途徑。已有實驗發現，NO合成抑制劑可以阻斷瘦素對ARC中Kisspeptin mRNA表達的作用，而在AVPV中幾乎無影響，這表明瘦素對中樞神經的作用至少部分是由氮能系統介導的[28]。位于PMV表達LepR的神經元投射到AVPV和ARC，可能參與瘦素對Kisspeptin分泌系統的間接作用。PMV中存在大量NO合成細胞，而正常條件下，細胞內NO的合成依賴于神經元型一氧化氮合成酶（nNOS）。瘦素干預后，PMV中nNOS和LepR的下游靶點p-STAT3共表達，這進一步表明NO介導了瘦素對Kisspeptin分泌系統的調節作用[32]。

表達LepR的神經元中有一部分是GABA能性（釋放神經遞質GABA的神經元），尤其是ARC中的LepR神經元，可占10%～45%。從GABA能神經元中敲除LepRb會導致嚴重的肥胖和代謝功能障礙；同時，該敲除小鼠還呈現生殖功能受損[18]。因此，此項研究表明小鼠正常生育力的維持也需要GABA能神經元中瘦素信號的傳導。

3.1.2 瘦素作用于垂體 瘦素能夠直接作用于垂體前葉發揮自分泌和旁分泌作用。在男性體內，垂體瘦素主要來自于生長激素細胞（somatotropes），可通過激活促性腺激素細胞（gonadotroph）中的NOS促進LH釋放，并促進少量FSH釋放。實驗證實NOS完全抑制劑可在大鼠垂體水平上抑制瘦素誘導的LH釋放[33]，但瘦素在垂體水平的具體作用機制還有待進一步闡明。

3.2 瘦素影響睪丸細胞結構及附屬腺功能

3.2.1 瘦素作用于Sertoli細胞 首先，瘦素可以通過調節Sertoli細胞中的糖代謝抑制生殖細胞的發育。Sertoli細胞從血液中吸收葡萄糖，其中大多數被代謝為丙酮酸，在乳酸脫氫酶的催化下轉化為乳酸，發育中的生精細胞優先利用乳酸。高水平瘦素可降低人睪丸Sertoli細胞的葡萄糖轉運蛋白2（GLUT2）水平和乳酸脫氫酶活性，抑制Sertoli細胞對丙酮酸的攝取與代謝，從而阻止生殖細胞的發育[3]。

其次，瘦素可通過調節Sertoli細胞中的乙酸代謝影響生精細胞的發育。Sertoli細胞在自身代謝中會產生大量的乙酸，它們是精子形成過程中合成脂質的重要碳源。病理性高水平瘦素可明顯降低Sertoli細胞乙酸的產量，從而阻止生殖細胞的發育[3]。

另外，瘦素可能通過損害血睪屏障（blood-testis barrier）而引起男性不育。Sertoli細胞間的緊密連接是構成血睪屏障的主要結構，血睪屏障可防止某些物質進出生精上皮，從而維持精子生長發育的微環境。過量外源性瘦素可降低小鼠Sertoli細胞中緊密連接相關蛋白的表達，從而干擾血睪屏障的完整性[13]。

3.2.2 瘦素作用于Leydig細胞 Leydig細胞的主要功能是合成和分泌雄激素。雄性哺乳動物血清中90%以上的睪酮由Leydig細胞分泌。有研究表明，肥胖男性的血清睪酮水平與脂肪量呈負相關，可能與瘦素抑制Leydig細胞合成和分泌睪酮有關[34]，但值得注意的是，瘦素本身不能直接影響Leydig細胞的合成和分泌功能，而是通過降低LH和人絨毛膜促性腺激素（hCG）水平，抑制這些激素誘導Leydig細胞合成和分泌睪酮[14]。

3.2.3 瘦素作用于前列腺和精囊腺 人前列腺和精囊腺上皮可能是精漿瘦素的來源之一。前列腺和精囊腺中的瘦素進入精液后，加速精子膽固醇外排和蛋白酪氨酸磷酸化，從而促進精子成熟。另外，瘦素作為有絲分裂原和抗凋亡因子，可通過絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和PI3K途徑促進前列腺癌細胞的生長，并且還可刺激前列腺癌衍生細胞系的增殖、遷移以及分泌生長因子等。因此，高瘦素水平可被認為是前列腺癌發生和轉移的一個危險因素[22]。

3.3 瘦素對精子發生和成熟的影響

3.3.1 精漿中瘦素的來源及作用 Glander等[35]發現輸精管切除術患者每次射精的瘦素量無明顯變化，精漿瘦素濃度與血清瘦素濃度無相關性，且顯著低于血清中瘦素濃度，這提示精漿瘦素可能僅來源于雄性生殖道。Cami?a等[24]比較40例健康男性和5例輸精管切除男性精漿瘦素水平后發現兩者差異無統計學意義。因此認為睪丸組織不是精漿瘦素的來源，其最可能的來源是精囊腺或前列腺組織。

精漿中的瘦素參與精子運動力發育的過程。當精漿中瘦素濃度相對較低，瘦素對精子形態和運動無負面影響，而瘦素濃度較高時，精子的數量和活力都與瘦素濃度呈負相關，推測較低濃度瘦素有維持或促進精子運動能力的作用。

3.3.2 瘦素導致生精細胞內氧化應激產生

3.3.2.1 瘦素增加精子活性氧簇（ROS）水平 已有研究表明，瘦素可引起精子所處環境的ROS水平增加。瘦素處理后，精子表達8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）水平升高[36]，這是細胞DNA氧化損傷檢測中最常用的生物學標志物之一。

瘦素可直接作用于生精小管上皮細胞線粒體，通過影響線粒體外膜通透性，使線粒體跨膜勢能耗竭，增加ROS產生。另一方面，瘦素處理后，線粒體中電子傳遞鏈相關酶表達顯著上調，而抗氧化酶、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶1（GPX1）、過氧化物酶1（Prdx1）和谷胱甘肽S-轉移酶pi 1（Gstp1）的表達均下調，最終可導致ROS的增加和氧化應激水平的提升[36]。

另外，瘦素還可通過與瘦素作用相關的途徑[腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、PI3K、MAPK和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路]發揮作用[37]。Md Mokhtar等[38]發現PI3K途徑抑制劑LY294002能減少瘦素對精子的負面影響，但AMPK途徑抑制劑卻見效甚微。

3.3.2.2 瘦素抑制精子ROS防御系統 瘦素引起氧化應激損傷的另一因素可能是瘦素抑制了抗氧化防御系統。瘦素處理的大鼠生精細胞其組蛋白-魚精蛋白的過渡受到損害。精子形成過程中，組蛋白被魚精蛋白取代是保護精子DNA的一個重要過程。經瘦素處理后，組蛋白被魚精蛋白替代不足，染色體DNA無法緊密包裝，因此，容易受到ROS的攻擊、增加DNA斷裂的可能性，而該過程可能通過下調魚精蛋白基因的表達實現[39]。

此外，組蛋白乙?；诰影l生中也起著重要作用。瘦素能夠加速組蛋白乙?；?，使染色質結構松散，更容易受到破壞，從而加大DNA損傷和斷裂的風險[39]。

3.3.3 瘦素在精子獲能中發揮重要作用 Aquila等[10]發現精子在獲能過程中可伴隨著瘦素的分泌量增加，提出瘦素可能在精子獲能中發揮重要作用。瘦素可觸發STAT3信號轉導路徑，誘導PI3K和MAPK通路及抗凋亡蛋白B細胞淋巴瘤/白血病2（BCL-2）的激活，從而增強精子的獲能指數和頂體蛋白酶活性[40]。研究發現瘦素處理后未獲能精子的膽固醇外排水平增加，這是獲能過程的啟動過程；蛋白酪氨酸磷酸化水平也會增加，這可以用于評價獲能的進度[10]。

另一方面，瘦素也會通過影響糖原合成酶活性，負向調節精子的獲能過程。糖原積累可為精子獲能提供能量。在未獲能精子中，瘦素會通過蛋白激酶B（Akt）途徑顯著降低糖原合酶激酶3S9（GSK-3S9）的磷酸化水平，下調糖原合成酶活性，從而降低糖原合成效率[10]。由此可見在生理狀況下精子獲能過程，瘦素濃度升高有利于獲能進展，而當瘦素濃度異常增高時可使精子獲能過程減緩或終止。

4 結語與展望

綜上所述，瘦素通過作用于HPG軸、睪丸組織Leydig細胞和精子對男性生殖系統發揮作用。其中，瘦素通過HPG軸的激素調節促進Leydig細胞合成分泌睪酮以及生精小管中精子的發生，在小鼠中體現為與性成熟調控有關。睪丸組織中，瘦素直接作用于Sertoli細胞和Leydig細胞，調節Sertoli細胞中乳酸的代謝，影響Leydig細胞分泌雄激素。對于精子，瘦素主要影響其發生、成熟和獲能過程。一方面，瘦素既可以誘導ROS的生成從而增加睪丸組織和生精細胞的氧化應激；另一方面也可降低生精細胞對ROS的抵御能力，最終造成生精細胞的損傷；此外，瘦素還能通過參與精子能量底物糖原的積累和STAT3信號途徑調節精子的獲能。

然而，瘦素間接作用于下丘腦GnRH神經元的確切機制還尚未完全明了，目前部分學者將目光投向瘦素作用于下丘腦參與機體代謝調節的神經轉導通路，探究其對生殖系統的影響。另外，瘦素及其受體在Sertoli細胞中的表達量較少，瘦素是否通過影響Sertoli細胞的功能從而影響精子發育也有待進一步研究。