棉花根際土壤古菌實時熒光定量PCR技術的建立及時空分布特征

管力慧，劉 萍，黨文芳，楊紅梅，牛新湘，楚 敏，李 萍，高 雁，曾 軍，霍向東，張 濤，林 青，歐提庫爾·馬合木提，李玉國，婁 愷，史應武,3,5

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830052；2. 新疆農業科學院微生物應用研究所，烏魯木齊 830091；3. 新疆特殊環境微生物實驗室，烏魯木齊 830091；4. 新疆農業科學院土壤肥料與農業節水研究所，烏魯木齊 830091；5. 農業農村部西北綠洲農業環境重點實驗室，烏魯木齊 830091；6. 新疆庫爾勒市農業技術推廣站，新疆庫爾勒 841000)

0 引 言

【研究意義】古菌(Archaea)作為生物領域的一類具有特殊性質，其細胞核無核膜包裹，細胞核和細胞質難區分，和細菌都屬于原核生物，但是在進化樹上與其有親緣關系的卻是真核生物。古菌不僅耐高溫、高鹽、低氧、強酸、強堿，還廣泛存在湖泊、土壤等普通環境中而且含量非常高[1]。棉花連作導致棉花黃萎病等土傳病害發生，影響棉花產量及品質。實時熒光定量PCR技術檢測不同生育時期與地區棉花根際土壤古菌數量，有利于探索根際土壤古菌與黃萎病之間的聯系以及防治棉花黃萎病?！厩叭搜芯窟M展】顧美英等[2]用平板計數法研究棉花的根際土壤，分析根際土壤微生物生態特征的變化情況以及根際土壤微生物特征變化與黃萎病病原菌的關系。Tellenbach等[3]建立了植物內生真菌實時熒光定量的方法。王晶等[4]運用熒光定量PCR技術和16S rDNA多態性分析對玉米不同生長時期土壤古菌多樣性變化進行研究。高峰等[5]用PCR定性測定土壤病原菌，沒有定量研究。2011年，肖蕊等[6]運用SYBR Green I PCR技術快速檢測棉花根際病原菌數量。PCR技術的發展，該方法也可用于古菌數量的檢測[7-8]。實時熒光定量PCR技術常用的檢測方法有SYBR Green I法和TaqMan探針法，TaqMan探針法原理是把含熒光素的TaqMan探針加入到反應體系中，通過變性、復性和延伸TaqMan探針被切斷，導致反應體系中熒光信號強度發生變化后通過標準曲線分析未知樣品[9-11]?！颈狙芯壳腥朦c】目前有關熒光定量的檢測方法廣泛應用于細菌和真菌的檢測，在古菌上的應用較少，且國內外對棉田古菌TaqMan探針實時熒光定量的相關研究還未見報道?！緮M解決的關鍵問題】運用TaqMan探針法檢測新疆不同地區及生育時期棉花根際土壤古菌數量，研究其根際土壤古菌的數量分布特征。對根際土壤古菌群落進行測序，分析其群落組成并進行風度比較。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試土樣

在棉花苗期、棉花蕾期、棉花花鈴期以及吐絮期對新疆北疆地區的石河子、烏蘇和精河；南疆的庫爾勒、圖木舒克和阿拉爾以及東疆的哈密共7個地區的棉花病株根際土壤(10～15 cm)進行采樣，用10目篩網將土壤過篩，混勻后裝入密封袋中于4℃冰箱中保存，待測[12]。

1.1.2 主要試劑

Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒、 SanPrep柱式質粒 DNA小量抽提試劑盒均來自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 主要儀器

德國艾本德Centeifuge 5418R型離心機(北京東南儀誠實驗室設備有限公司) ；DW-40L188 型醫用低溫保存箱(杭州艾普儀器設備有限公司) ； TPersonal型PCR儀(杭州博日科技有限公司) ；DYCP-31E型電泳儀(北京六一儀器廠) ；WD-9413B型凝膠成像分析儀(北京市六一儀器廠) ；OSE-260型超微量分光光度計(濟南利科醫療器械有限公司) ；Roche Light Cycle 480Ⅱ型實時熒光定量PCR儀(羅氏醫學儀器公司) 。

1.2 方 法

1.2.1 土壤微生物基因組總DNA的提取

在每個棉區隨機選取4個生育期的土樣，按照Ezup柱式土壤基因組DNA抽提試劑盒上的操作步驟提取土壤基因組總DNA，將提取到的DNA樣品進行標記并放入-20℃的冰箱保存[13]。

1.2.2 RT-PCR反應體系的建立及優化

以土壤基因組總DNA為模板，采用古菌16S rDNA基因特異引物524F(5’-TGYCAGCCGCCGCGGTAA-3’)和806R (5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)[14]對不同時期的根際土壤基因組DNA進行PCR擴增，探針兩端用FAM和BHQ1進行標記，把不加模板的作為陰性對照，每個操作重復3次。反應體系為: 模板5 μL，引物各0.8 μL，FS Essential DNA Probes Master 10.0 μL，探針0.4 μL，ddH2O 3 μL，總體系為20 μL，反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性25 s，56℃退火120 s，72℃延伸90 s，共進行45個循環[15]。用1.8%瓊脂凝膠電泳檢測產物，Illumina MiSeq測序平臺對擴增的基因序列進行高通量測序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.2.3 重組質粒的構建與鑒定

用DNA膠回收試劑盒純化擴增產物，然后進行質粒的構建并轉化到大腸桿菌感受態細胞中，在含氨芐青霉素平板上進行藍白斑試驗篩選出陽性轉化菌[16]。

1.2.4 標準曲線的建立

以拷貝數1.145×108copies/g (FRW)的質粒為基礎，獲得6個拷貝數分別為1.145×107、1.145×106、1.145×105、1.145×104、1.145×103、 1.145×102copies/g (FRW)質粒標準品。將7個不同濃度的標準品進行熒光定量檢測。

用質粒DNA抽提試劑盒提取陽性轉化菌DNA，再用超微量分光光度計測定OD600值，計算得出質粒濃度并按梯度進行稀釋，檢測已稀釋的不同濃度質粒標準品，在Roche Light Cycle 480軟件內拷貝數據，用Origin 8.5軟件作圖并生成方程，建立Ct值與棉花根際土壤古菌濃度之間的線性關系。

1.2.5 樣品的熒光定量PCR檢測

對提取的DNA進行擴增，后進行熒光定量PCR檢測，將得到的樣品Ct值帶入上述重組質粒DNA構建的標準曲線方程中，計算棉花根際土壤古菌的含量(copies/g FRW)。

1.3 數據處理

運用Origin8.5和Excel軟件對數據作圖。用Flash軟件對測序得到的雙端序列數據根據overlap關系進行拼接，用Uchime軟件去除嵌合體，獲得高質量序列。在Usearch(version 7.0)平臺上將相似性不小于97%的序列為同一操作分類單元(operation taxonomic unit, OTU)，為了得到每個OTU對應的物種分類信息，與Silva數據庫中基因序列數據庫進行比對，采用RDP classifier算法對97%相似水平的OTU代表序列分析在分類學水平上根際土壤古菌群落組成[17,18]。

2 結果與分析

2.1 標準曲線繪制

研究表明，標準曲線的相關系數R2=0.999 5，標準品的濃度與循環數Ct存在極強的相關性。曲線的截距為45.5，斜率為-3.546 9。出棉花根際土壤古菌x(DNA起始濃度對數值)與y(Ct值)之間的關系為y=-3.546 9x+45.5 。圖1，圖2

圖1 10倍梯度稀釋陽性質粒的熒光定量PCR擴增曲線Fig.1 Real-time PCR amplification curve of serial 10 fold dilutions of positive recombinant plasmids

圖2 10倍梯度稀釋陽性質粒的熒光定量PCR標準曲線Fig.2 RT-qPCR standard curve of serial 10 fold dilutions of positive recombinant plasmids

2.2 不同生育時期新疆棉田根際土壤古菌數量變化及群落豐度

研究表明，哈密、石河子、圖木舒克和烏蘇變化趨勢在苗期至絮期呈相似狀態，從苗期后一直在減少，花鈴期達到最低隨后開始增加，在吐絮期數量最大，其中哈密根際古菌數量吐絮期達到最大值1.75×106copies/g (FRW)；精河和庫爾勒的變化都是從苗期緩慢增加，蕾期后又減少，花期又增加，在吐絮期兩地根際古菌數量達到生育期最大值1.0×106copies/g (FRW)；而在阿拉爾地區苗期為5.4×105copies/g (FRW)，從苗期開始一直在降低，吐絮期降到最低1.1×104copies/g (FRW)。 Soil_Crenarchaeotic_Group_SCG在4個生育時期豐度最高是在蕾期達79.94%，苗期最低為75.5%。Unclassified_p_Thaumarchaeota在生育時期豐度差異最大，吐絮期最高達7.12%，苗期為1.06%。Halobacteria的豐度極低在蕾期僅為0.01%，苗期最高只有0.4%。圖3，圖4

圖3 不同生育時期棉花根際土壤古菌數量變化Fig.3 Variation of number of Archaea in rhizosphere soil of cotton in different growth stages

圖4 不同生育時期棉花根際土壤古菌群落豐度Fig.4 Abundance of Archaea community in cotton rhizosphere soil in different growth stages

2.3 不同地區根際土壤古菌的數量變化及群落豐度

研究表明，在北疆地區，烏蘇土壤古菌數量高于石河子和精河；南疆地區庫爾勒土壤古菌數量在棉花苗期、蕾期和花鈴期均比阿拉爾與圖木舒克高，但在吐絮期比圖木舒克低、比阿拉爾高。除阿拉爾外不同采樣點的棉花病株根際土壤古菌在吐絮期數量較高，其中顯著較高的地區依次為哈密、烏蘇、圖木舒克；苗期精河棉花病株根際土壤古菌的數量同其他幾個地區相比最少僅有1.4×104copies/g(FRW)，此外精河、石河子和烏蘇3個地區除在吐絮期外的生育時期的土壤古菌數量都很少；庫爾勒地區的根際土壤古菌的數量在整個生育期變化不大呈現穩定趨勢。棉花根際土壤古菌群落中SCG綱豐度最高在哈密地區為88.84%，最低是在阿拉爾為58.24%；相反熱原體綱(Thermoplasmata)豐度最高是在阿拉爾地區為26.19%，哈密最低是9.66%；Marine_Group_I豐度最高是在阿拉爾為7.13%，哈密和石河子僅有0.01%；Halobacteria綱在精河地區豐度最高為0.43%，阿拉爾為0.03%，在哈密和石河子卻不存在這一類群。圖5，圖6

圖5 不同地區棉花根際土壤古菌數量變化Fig.5 Variation of number of Archaea in rhizosphere soil of cotton in different locations

圖6 不同地區棉花根際土壤古菌群落豐度Fig.6 Abundance of Archaea community in cotton rhizosphere soil in different locations

3 討 論

近年來，我國關于土壤微生物的研究越來越多，古菌作為一類耐高溫、高鹽、低氧、強酸、強堿的生物，在生態環境中具有不容忽視的作用。陳金全等[19]通過構建克隆文庫和實時熒光定量PCR的方法，對珠江口海岸帶沉積物氨氧化細菌和古菌組成及定量進行研究。王晶等[4]運用熒光定量PCR技術和16S rDNA多態性分析對玉米不同生長時期土壤古菌多樣性變化進行研究，發現提高土壤古菌的多樣性對生態環境大有好處并促進植物生長。研究對棉花不同生育時期以及不同地區的土壤古菌數量進行研究，但土壤古菌的多樣性以及是否對棉花生長有促進作用有待進一步研究。棉花根際微生物對棉花健康有很重要的影響，因此，探究土壤微生物對棉花黃萎病的影響對棉花黃萎病的防治有十分重要的意義。目前已經有很多學者對棉花土壤中的微生物進行了定量研究，但對于棉花根際土壤古菌的研究還較少，張濤等[12]運用實時熒光定量PCR技術對新疆棉花根際土壤細菌數量進行時空動態分析，黨文芳等[13]采用熒光定量PCR方法研究新疆不同地區以及不同生育時期棉花根際土壤真菌數量變化并探討真菌與病原菌之間關系。研究首先建立了土壤古菌的實時熒光標準曲線，并對新疆棉花根際土壤古菌進行實時熒光定量PCR檢測。劉珊珊等[20]對棉花不同發育時期根際微生物的動態變化進行了研究，但尚未發現針對不同地區土壤古菌的研究。采用熒光定量PCR技術對不同地區及不同生育時期的棉花土壤古菌數量進行動態變化研究。研究了棉花黃萎病病株根際土壤古菌數量變化趨勢，對于古菌在不同土壤環境中的適應能力還需進一步的研究。

4 結 論

建立快速檢測棉花根際古菌數量的實時熒光定量PCR技術發現新疆棉花根際土壤古菌數量在不同地區以及不同生育時期的變化較為明顯，哈密、石河子、圖木舒克和烏蘇根際古菌數量均呈現先減少后增加的變化趨勢，其中哈密的病株土壤古菌的數量與其余幾個地區相比是最高的，在棉花的4個生育時期內，土壤古菌的數量在吐絮期最高達1.75×106copies/g (FRW)，SCG綱豐度最高是在蕾期為79.94%。精河和庫爾勒根際古菌數量變化趨勢為先升后降再升，精河地區土壤古菌數量在苗期最低為1.4×104copies/g(FRW)。阿拉爾根際古菌數量一直在減少，吐絮期最低1.1×104copies/g (FRW)。SCG綱在阿拉爾地區豐度最高為88.84%。