不同因素影響下棉田土壤中大麗輪枝菌微菌核的數量特征

劉海洋，王 偉，張仁福，溫切木·阿布列孜，姚 舉

(1. 新疆農業科學院植物保護研究所/農業部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091；2. 阿勒泰市菜籃子工程辦公室, 新疆阿勒泰836500)

0 引 言

【研究意義】2019年新疆棉花種植面積和產量均占全國的80%以上，多年的大規模連續種植，新疆棉花黃萎病發生嚴重。2015年阿克蘇、石河子、烏蘇等地黃萎病發生棉田均超過70%，全疆棉田發病率50%以上[1]，已影響到優質棉基地的建設和棉花產業的長效發展?！厩叭搜芯窟M展】土壤中大麗輪枝菌Verticilliumdahliae的微菌核是棉花黃萎病的主要侵染源，微菌核數量與黃萎病的發生程度呈顯著正相關[2]。微菌核抗逆性強，在40～50℃下處理24 h仍有部分微菌核存活[3]，其主要聚集或均勻分布在0～20 cm的耕層中[4]。土壤溫度、濕度、pH以及有機質含量能夠影響微菌核的生長[5]，偏堿性條件下，棉花黃萎病菌產生微菌核的能力較強，氯化物、硫酸鹽能夠促進微菌核的形成[6]，棉花連作年限長土壤中微菌核數量會增加[7]。降低土壤中的微菌核數量是棉花黃萎病防控的重要措施，利用西蘭花殘渣或幾丁質粉的生物熏蒸技術可降低棉花黃萎病的發生程度和土壤中微菌核的數量，該技術存在茬口難以匹配的現狀[8]；棉田深翻改土也能有效降低淺耕作層中的微菌核的數量，減輕黃萎病的發生程度[9]。Lpezescudero等[10]將Diplotaxisvirgata,Lavandulastoechas和Thymusmastichina制成有機改良劑施用，棉花黃萎病菌產生微菌核的能力顯著降低，棉花黃萎病的發病程度得到了有效抑制。作物輪作倒茬是防控棉花黃萎病的主要農業措施。姚琴等[11]研究表明，韭菜根系分泌物能夠明顯抑制微菌核的萌發；但是，在實際作物輪作過程中，Huisman等[12]發現當土壤中存在一定數量的微菌核時，種植對黃萎病菌免疫的作物對微菌核的生存影響不大，且由于微菌核在土壤中自然減退率低，作物短期輪作對棉花黃萎病的防治意義不大；Borza等[13]同樣發現，芥菜與棉花輪作未能降低土壤中黃萎病菌的豐度?！颈狙芯壳腥朦c】除作物輪作與種植抗病品種外，棉花黃萎病的防治尚無有效的防控措施，并且現階段對新疆棉區棉田不同環境土壤中微菌核的分布特征還不明晰。研究外界因素對土壤中微菌核數量的影響特征?！緮M解決的關鍵問題】利用熒光定量PCR方法和選擇性平板分離技術，大田試驗與室內試驗相結合系統分析棉田土壤中微菌核的自然分布特征以及棉稻間作、種植抗病性棉花品種、盆栽水淹等因素對土壤中微菌核數量的影響，分析外界因素對大麗輪枝菌微菌核分布的影響，為新疆棉花黃萎病的暴發成災提供預測預警支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 品 種

棉花品種：新疆農業科學院植物保護研究所提供的耐病品種中植棉2號、新陸中66號、以及感病品種軍棉1號；中國農業科學院植物保護研究所提供的耐病材料K3、中5；水稻品種為新疆農業科學院核生物技術研究所提供的新稻11號，所有作物均于2018年4月18日種植。

1.1.2 土 壤

2018年分不同時期在農業部庫爾勒作物有害生物科學觀測實驗站(E85.801821、E41.750644)內的棉花黃萎病病圃采集棉田10 cm耕層土壤，該病圃自2014年通過人工接種大麗輪枝菌建設而成，棉花黃萎病發生嚴重、均勻。

1.1.3 引 物

檢測大麗輪枝菌的特異引物：大麗輪枝菌上游引物 5′-CGTTTCCCGTTACTCTTCT-3′，大麗輪枝菌下游引物5′-GGATTTCGGCCCAGAAACT-3′[14]，由美國英杰生命技術有限公司合成。

1.1.4 試 劑

DCP336土壤基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；Cw0716 2×TaqMasterMix、Cw2591s Puc-TTAcloningkit，Cw0808s感受態細胞DH5α，北京康為世紀生物科技有限公司；RR82LR SYBR?PremixExTaqTMII (Tli RNaseH Plus)、ROXplus 、3427Q DL2000 DNA Marker，TaKaRa。

1.1.5 儀 器

QL-902渦旋振蕩儀，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Centrifuge5415D離心機，Eppendorf；NANODROP 2000分光光度計，Thermo scientific；Tanon1600凝膠成像系統，上海天能科技有限公司；ABI7500 AppliedBiosystems熒光定量 PCR儀，ABI。

1.2 方 法

1.2.1 土壤中微菌核分離法效果

2018年在實驗站病圃內均勻設置長度5 m小區，標準膜寬小區，隨機設單種新稻11號(X11)、新陸中66號(X66)、軍棉1號(J1)以及新稻11號+新陸中66號(X+X)套種4處理，沒處理取5份土樣。于7月10日采集實驗站內各處理土壤并采集相鄰輕病田土壤(LD)5份，利用熒光定量PCR技術檢測土壤中大麗輪枝菌的基因拷貝數，利用選擇性平板分離技術分析土壤中大麗輪枝菌的微菌核數量。

1.2.1.1 熒光定量PCR檢測

提取土壤樣本的基因組DNA，用大麗輪枝菌目的基因引物進行PCR擴增，回收PCR產物進行TA連接，利用菌落PCR鑒定陽性克隆后提取質粒作為絕對定量的標準品，之后將所有 DNA 樣品分別配置 Realtime PCR反應體系，將質粒標準品從 101～105進行10倍梯度稀釋，每個梯度取2 μL做模板建立標準曲線，將上述 96孔PCR 板置于Realtime PCR儀上進行 PCR反應。委托北京奧維森基因科技有限公司對2019年7月10日在實驗站采集的輕病田(LD)、X11、Z49和X+Z以及J1處理的根際土壤樣品利用絕對定量法檢測土壤DNA中大麗輪枝菌的基因拷貝數，5個處理，每處理5個重復。

1.2.1.2 選擇性平板分離

配制選擇選擇性培養基[15]，稱取3 g土壤樣品用研缽研細，3份，分別放入盛有200 mL水的三角瓶中，加入少量玻璃珠，靜置10 min，在200 r/min的搖床上搖30 min。然后倒入上層150 μm，下層38 μm的雙層細篩，在自來水下將泥土沖洗干凈。留在下層篩網上的土壤殘留物全部轉移到50 mL三角瓶中，用無菌水定容到30 mL。將定容好的土樣液用移液槍每次均勻吸取2 mL，于改良微菌核選擇分離培養基表面均勻涂布，接種5皿(接種前將三角瓶中的土樣液充分搖勻)，放在超凈工作臺上吹干，在28℃下黑暗培養10 d進行檢查。每5皿的檢驗結果數目之和就是所測1 g土樣中所含棉花黃萎病菌微菌核的數量，3次重復。

1.2.2 棉田土壤中大麗輪枝菌微菌核的數量1.2.2.1 棉田土壤中微菌核的區域分布特征

在病圃內均勻設置長度5 m，標準膜寬小區，橫向5個處理，豎向4重復，共計20個小區。于5月20日每個小區采集1份土壤樣品利用選擇性平板分離方法檢測，分析棉田不同區域土壤中的微菌核數量差異。

1.2.2.2 不同作物根圍土壤中微菌核的數量

于7月10日、10月10日分別在1.2.1小節設計的X11、X66、X+X 三個處理，取種植不同作物的根際土壤，利用選擇性平板分離方法檢測土壤中微菌核的數量，每處理取6個土樣，分析種植對大麗輪枝菌免疫作物后土壤中微菌核的數量差異。

1.2.2.3 不同抗病性棉花品種根圍土壤中微菌核的數量

在病圃內隨機種植中5(Z5)、K3、軍棉1號(J1)3種不同抗病性的棉花品種，3重復，每處理取6個土樣，于7月10日分別取各處理根圍土壤，利用選擇性平板分離方法檢測土壤中微菌核的數量，分析不同抗病性棉花品種根圍土壤中微菌核的數量差異。

1.2.3 室內盆栽土壤中大麗輪枝菌微菌核數量

取病圃內土壤混勻后進行室內盆栽試驗，試驗前土壤利用選擇性平板分離方法檢測4次，每次3個重復。選擇直徑22 cm，深20 cm的盆缽。

1.2.3.1 不同抗性棉花品種與水稻混種對土壤中微菌核的影響

設置5處理，其中單種中植棉2號(Z2)、軍棉1號(J1)2處理各種植10粒；2個混種處理中植棉2號+新稻11號(Z+X)、軍棉1號+新稻11號(J+X)各種植10粒棉籽和10粒稻種；空白對照(CK)不種植任何作物，共計5個處理，每處理3重復。種植90 d后采集各處理土壤，利用選擇性分離培養基檢測微菌核的數量，分析不同抗病性棉花品種以及與稻混種對土壤中微菌核影響。

1.2.3.2 水淹及種稻對盆栽土壤中微菌核影響

設水淹(W)、水淹+新稻11號(W+X)2處理，其中W+X處理每盆種植10粒稻種。每處理設10、20、30、60、150 d 5個時間梯度取土壤樣品，每個時間梯度5個重復，定期取土樣利用選擇性分離培養基檢測土壤中微菌核的數量。

1.3 數據處理

利用 Excel 軟件對常規數據進行整理、匯總，利用 SPSS 19.0 軟件的 ANOVA 程序中Duncan分析法對數據進行差異顯著性分析，P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 土壤中微菌核分離法效果

研究表明，不同處理之間存在顯著差異，其中在新陸中66號根圍土壤DNA中大麗輪枝菌靶標片段基因的拷貝數最高，為2.01×106/μL，大麗輪枝菌基因拷貝數為2.41×108拷貝/g土，顯著高于輕病田對照；新稻11號、新陸中66號、新稻11號+新陸中66號3個處理土壤中大麗輪枝菌基因拷貝數沒有顯著差異，軍棉1號處理土壤中大麗輪枝菌基因拷貝數顯著低于新陸中66號處理。

不同處理之間同樣存在顯著差異。新陸中66號處理土壤中大麗輪枝菌微菌核數量最高，為124.2個/g，顯著高于輕病田對照，與新稻11號+新陸中66號處理無顯著差異，與實時定量PCR檢測結果基本一致。與實時定量PCR技術相比，選擇性平板分離技術同樣能準確的判斷不同土壤中的大麗輪枝菌的豐度。表1

2.2 棉田土壤中大麗輪枝菌微菌核的數量

2.2.1 棉田土壤中微菌核的區域分布特征

研究表明，5月20日采集的20個小區土壤中微菌核數量最高的為59個/g，最低僅有14個/g平均為29.4個/g，其中微菌核數量高于或低于30個/g的土壤樣本各10個，分別占50%，不同小區之間存在顯著差異，棉田土壤中微菌核呈聚集分布。圖1

注：不同小寫字母表示不同土壤樣品中微菌核的數量差異顯著(P<0.05),誤差線表示平均值的標準誤差(n=4),1～20代表不同的土壤樣品編號

2.2.2 不同作物根際土壤中微菌核的數量

研究表明，7月10日，新稻11號根際土壤中微菌核數量平均為59.2個/g，新陸中66號根際土壤中微菌核數量為124.2個/g，新稻11號+新陸中66號處理土壤中微菌核數量為116.2個/g，新稻11號根際土壤中微菌核數量顯著低于新陸中66號根際土壤，而新稻11號+新陸中66號處理與新陸中66號處理沒有顯著差異；與5月土壤相比，7月10日 新陸中66號、新稻11號+新陸中66號處理土壤中微菌核的數量均明顯上升，分別增加了94.8和87.2個/g，新稻11號根際土壤中微菌核數量僅增加了29.8個，種植水稻明顯減緩了土壤中微菌核的上升速度。

至10月10日，3個處理土壤中微菌核數量分別為98.3、92.5和101.2個/g，處理之間沒有顯著差異。與7月10日相比，新稻11號+新陸中66號處理與新陸中66號處理土壤中微菌核數量略為減少，而新稻11號根際土壤中微菌核數量增加了33.3個/g。生長后期，水稻對土壤中微菌核生長的抑制能力減弱。圖2

注：X66：新陸中66號，X11：新稻11號，X+X：新稻11號+新陸中66號不同小寫字母表示不同土壤樣品中微菌核的數量差異顯著(P<0.05)； 誤差線表示平均值的標準誤差(n=6)

2.2.3 不同抗病性棉花品種根圍土壤中微菌核的數量

研究表明，5月20日，感病品種軍棉1號根圍土壤中微菌核含量為48.3個/g；耐病材料中5根圍土壤中微菌核含量為40.0個/g，低于感病品種軍棉1號；而耐病品種K3根圍土壤中微菌核含量為69.3個/g，高于感病品種軍棉1號。

7月10日，感病品種軍棉1號根圍土壤中微菌核含量為53.8個/g，較5月20日增加5.5個/g；耐病品種中5與K3根圍土壤中微菌核含量分別為56.3和65.7個/g土，分別高于感病品種軍棉1號2.5和11.9個/g；相比5月20日，耐病品種中5根圍土壤中微菌核數量增加16.3個/g土，而耐病品種K3根圍土壤中微菌核數量減少3.6個/g。

棉花根圍土壤中微菌核的數量與棉花品種的抗病性無明顯相關。圖3

注：J1：軍棉1號；誤差線表示平均值的標準誤差(n=6)

2.3 室內盆栽驗證不同處理方式對土壤中微菌核的影響

2.3.1 不同抗性棉花品種與水稻混種對土壤中微菌核的影響

研究有明，盆栽試驗前土壤中微菌核的數量為47.4個/g。出苗90 d后，空白對照土壤中微菌核的數量為57.0個/g，較盆栽前略為升高；與空白對照相比，耐病品種中植棉2號根際土壤中微菌核數量為57.3個/g，2處理之間無顯著差異；感病品種軍棉1號根際土壤中微菌核數量為35.3個/g，與空白對照相比下降11.7個/g。感病品種軍棉1號根際土壤中微菌核數量較耐病品種低。

與新稻11號混種后，中植棉2號+新稻11號混種處理土壤中微菌核的數量較單種中植棉2號處理減少12.3個/g，而軍棉1號+新稻11號混種處理土壤中微菌核數量較單種軍棉1號處理增加17.4個/g。與稻混種后土壤中微菌核數量的變化沒有表現出一致規律。圖4

注：PCK:試驗前對照，CK：同期對照，Z：中植棉2號，J1：軍棉1號，Z+X:中植棉2號+新稻11號，J+X：軍棉1號+新稻11號，誤差線表示平均值的標準誤差(n=3)

2.3.2 水淹及種稻對盆栽土壤中微菌核的影響

研究表明，水淹10 d后，純水淹處理土壤中微菌核數量為47.7個/g，與試驗前土壤中微菌核的數量47.4個/g土相比，無明顯變化；20 d后，空白對照土壤中微菌核數量顯著上升至121.7個/g；至30 d，空白土壤中微菌核數量顯著上升至231.7個/g；至60 d，空白土壤中微菌核數量下降至193.3個/g；至150 d后，微菌核數量又恢復上升至239.0個/g。水淹后土壤中微菌核的數量顯著增加。

新稻11號水淹處理土壤中微菌核的消長動態與空白對照一致，同樣表現為迅速升高繼而降低再升高的趨勢。2處理在0～20 d時土壤中微菌核含量沒有顯著性差異；至30 d時，新稻11號水淹處理土壤中微菌核數量為347.0個/g，顯著高于空白對照，至60 d時，微菌核數量降至155.0個/g，低于空白對照；至150 d時，新稻11號水淹處理土壤中微菌核數量顯著升高至385.7個/g。

室內盆栽條件下，水淹顯著促進了土壤中微菌核數量的增長，種植水稻未能抑制土壤中微菌核的增長。圖5

注：不同小寫字母表示不同土壤樣品中微菌核的數量差異顯著(P<0.05), 誤差線表示平均值的標準誤差(n=5)

3 討 論

微菌核是大麗輪枝菌在土壤中的主要存活體，其在土壤中主要呈聚集或均勻分布[4]。對棉田土壤中的大麗輪枝菌進行定量是對黃萎病預警、合理進行品種布局預防棉花黃萎病的基礎[16]。目前檢測土壤大麗輪枝菌主要采用實時熒光定量技術[17]和選擇性平板分離的方法，其中熒光定量技術具有精準的優勢。因為在輕病田中利用實時定量PCR技術檢測到的大麗輪枝菌基因拷貝數量級很高。研究發現，選擇平板分離技術對棉田中微菌核的檢測準確度很高，具有分離到病原菌以便進行后續研究的優勢，該方法在區分輕病田與重病田方面更明顯。庫爾勒實驗站棉花病圃內大麗輪枝菌微菌核在土壤中呈聚集分布，不同采樣點微菌核的數量存在顯著差異，由于該病圃建設年限僅5年，土壤中微菌核分布不均勻可能與病圃的建立年限較短有關。

Knox等[18]研究表明，不同棉花品種與根際土壤微生物的相互作用存在差異，抗、感黃萎病棉花品種間根際微生物種類存在明顯不同[19]，抗病品種根際土壤中枯萎菌數量明顯少于感病品種[20]；Huisman等[12]研究表明，感病棉花品種能刺激微菌核增長，繼續種植抗病品種時土壤中微菌核數量會繼續增多，吳玉香等[21]認為抗病棉花品種根系分泌的精氨酸可能抑制黃萎病菌的生長發育，而感病品種根系分泌的丙氨酸刺激黃萎病菌的生長。同塊棉田中采集的不同抗病性棉花品種根圍土壤中微菌核的數量與棉花品種的抗病性無明顯相關，甚至感病品種根圍土壤中微菌核數量低于抗病品種，盆栽試驗結果與大田結果較一致，可能棉花的根系分泌的物質影響范圍有限，不能對棉花根圍土壤的微生態環境造成明顯影響，抑或由于感病品種軍棉1號后期發病死亡，根系停止分泌化感物質到土壤中，對根圍土壤中微菌核的刺激降低所致。

不同作物對土壤中微生物群落多樣性的影響具有顯著差異[22]。研究發現，水稻根系分泌物能有效抑制尖孢鐮刀菌孢子萌發，對土壤中西瓜枯萎病致病菌具有抑制作用[23]。蘇世鳴等[24]發現西瓜間作旱稻可顯著降低西瓜根際土壤中的尖孢鐮刀菌的數量。此外，玉米、萵苣的根系分泌物同樣能夠抑制尖孢鐮刀菌的生長[25]；擬南芥的根系分泌物能夠抑制多種土傳病原菌的生長[26]。作物輪作在防治土傳病害方面具有天然的優勢，生產中同樣利用水旱輪作的方式來防治棉花土傳病害。研究了旱稻與棉花間作對土壤中大麗輪枝菌微菌核數量的影響作用，研究發現，在大田中，前期種植旱稻能夠減緩了土壤中微菌核數量的增長速度，但后期對微菌核沒有抑制作用；室內盆栽同樣發現旱稻與不同抗病性棉花混種沒有降低土壤中微菌核的數量，尤其是在水淹的條件下，稻-棉混種的土壤中微菌核的數量顯著增加，這可能與微菌核極強的抗逆性有關，該結果與Huisman[12]、Borza[13]的研究結論較為一致。

利用不同作物間作、輪作是防治土傳病害的主要措施。研究發現，短期內，種植不同抗病性棉花品種抑或對大麗輪枝菌免疫的稻均對土壤中微菌核的生存均沒有顯著影響，而土壤長時間濕度大的情況下，稻-棉間作促進了土壤中微菌核的增長，該結果有待進一步驗證。楊家榮等[5]研究發現在高濕、密閉條件下土壤中微菌核存活數量顯著降低，可能與土壤通氣狀況不佳導致病菌缺氧呼吸有關。而研究發現在開放、盆栽水淹條件下，土壤中微菌核數量顯著增加，從側面證實了楊家榮等[5]土壤通氣狀況不佳導致病菌缺氧影響微菌核存活的結論。新疆棉田長年連作并秸稈還田導致了病原菌的加速積累，馬云艷等[27]研究發現將棉稈炭化還田具有改善土壤理化性質并從源頭阻止黃萎病菌在土壤中積累的優點。薛磊等[6]研究發現偏堿性條件能增強棉花黃萎病菌產生微菌核的能力，而新疆棉田土壤多為偏堿性，這是否為新疆棉田中微菌核數量逐漸增多的原因值得分析。

4 結 論

棉田土壤中大麗輪枝菌難以通過作物單生長季內輪作有效消除，大麗輪枝菌微菌核在棉田土壤中呈聚集性不均勻分布，土壤中大麗輪枝菌微菌核的數量與棉花品種抗病性無明顯相關。7月旱作水稻、棉花根際土壤中微菌核分別為59.2和124.2個/g，旱作水稻顯著低于棉花，10月旱作水稻、棉花根際土壤中微菌核分別為92.5和98.3個/g，2處理之間已無顯著差異，種植旱稻生長前期能延緩棉田土壤中大麗輪枝菌微菌核的增長，生長后期對微菌核的影響能力降低。水淹30 d時土壤中大麗輪枝菌微菌核的數量顯著上升至231.7個/g，至60 d土壤中微菌核數量略下降，至150 d時微菌核數量升至239.0個/g，是初期微菌核數量的5倍；種稻處理土壤中微菌核的消長動態與水淹處理一致，至150 d時微菌核數量385.7個/g是初期的8倍，水淹顯著促進土壤中微菌核數量的增長，水淹條件下水稻未能抑制土壤中微菌核數量的增長。