DNA條形碼技術結合形態學特征鑒定中國一新紀錄種-艾弗斯曼多眼蝶

郭文韜，努日耶·木合太爾，羅順剛，鐘 問，胡紅英

(新疆大學生命科學與技術學院/新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046)

0 引 言

【研究意義】多眼蝶屬KiriniaMoore隸屬于鱗翅目Lepidoptera、眼蝶科Satyridae，世界已知6種均分布于古北區，中國目前已知1種：多眼蝶Kiriniaepaminondas，主要分布于北京、黑龍江、遼寧、山東、河南等地[1]。通過對近年來在新疆伊犁哈薩克自治州霍城縣中華福壽山景區采集的蝴蝶標本進行整理，發現了該屬1中國新紀錄種：艾弗斯曼多眼蝶Kiriniaeversmanni。目前關于鱗翅目中的分類鑒定主要依據翅和雄性外生殖器的特征[2]，主要以物種間因外生殖器的不同形成的種間生殖隔離為出發點，雄性外生殖器的結構復雜且種間差異明顯為據[3]。研究將雄性外生殖器的形態特征與DNA條形碼技術相結合，對艾弗斯曼多眼蝶進行識別和鑒定，為其鑒定提供可靠依據，同時豐富國內多眼蝶屬物種記錄情況，為該屬物種的相關研究奠定基礎。 【前人研究進展】目前國內外對于多眼蝶屬物種的相關研究工作甚少，且關于該屬的詳細鑒定工作暫無研究。Hebert等[4]在提出DNA條形碼技術后將這一技術應用到昆蟲鑒定，分析了200個親緣關系較近的鱗翅目昆蟲的COI片段，結果表明，200個鱗翅目昆蟲100%被準確區分；Hajibabaei等[5]研究了鱗翅目中的弄蝶科(Hesperiidae)、天蛾科(Sphingidae)和大蛾科(Saturniidae)521個物種4 260個樣本，97.9% 的物種能夠準確無誤的被鑒定，證明DNA條形碼對于物種鑒定的有效性；Vladimir等[6]研究發現當地理覆蓋范圍擴大后并不妨礙物種分子水平的鑒定，結果表明，即使是在一個大的地理區域的分類單元采樣，DNA條形碼仍然是一個有效的識別工具。武宇鵬[7]為檢驗DNA條形碼在鱗翅目中鑒定的可行性選取71頭夜蛾科Noctuidae標本利用系統發育樹、遺傳距離、閾值等方法進行了鑒定和比較分析，發現基于cox1基因的鑒定成功率達到了100% ，而基于28S則很低，為64.8%。用不同方法構建的系統發育樹，鑒定結果均相同。然而DNA條形碼也有一些爭議，有些分類學家認為DNA條形碼作為物種分類鑒定依據時其分子數據權重過大，片段單一，以及受限于數據庫中參照序列的多少等[8]。DNA條形碼仍不失為一種極為有效的昆蟲物種鑒定工具，如ITS2[9]、rRNA[10]以及cytb[11]等適當增加和補充一些其他基因序列信息也很必要。Bonfantt等[12]研究了新熱帶螯蛺蝶亞科Charaxinae 13屬31種的雄性外生殖器超微結構，發現其在屬、種之間均有明顯差異。洪健等[13]對虎鳳蝶屬Luehdorfia雄外生殖器的超微結構進行了比較，認為抱握器，鉤形突、陽莖、陽莖軛片等部位超微結構的差異可作為虎鳳蝶屬不同種的形態鑒定依據；蔣玲玲、曹文秋等[14-15]通過對雄性外生殖器的結構比較對云粉蝶屬Pontiadaplidice以及新疆7種具有代表性的蛺蝶科(Nymphalidae)進行準確鑒定并制作檢索表。隨著對整合分類學的認識不斷加深，對于物種的鑒定技術的綜合運用也越來越廣泛，集形態、分子及生態數據為一體的綜合分類法將會使昆蟲未來物種鑒定更為科學和準確[16-18]。如陳光輝[19 ]等通過DNA條形碼技術與外生殖器特征鑒定相結合的方法成功鑒定榆綠毛螢葉甲Pyrrhaltaaenescens。 【本研究切入點】目前國內對多眼蝶屬的相關研究極少。在新疆伊犁州霍城縣清水河鎮發現該屬中國新紀錄種，利用DNA條形碼技術結合其雄性外生殖器特征和翅面結構對該物種進行描述鑒定，為該物種提供更多的分類特征。 【擬解決的關鍵問題】采集艾弗斯曼多眼蝶標本， 運用整合分類學方法，為該中國新紀錄種提供可靠鑒定依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 昆蟲

艾弗斯曼多眼蝶標本采于2016～2017年，采集地點為新疆霍城縣清水河鎮大西溝鄉中華福壽山景區廟內。標本保存于新疆大學生命科學與技術學院昆蟲標本館。表1

表1 標本采集信息Table 1 Collecting information of specimens

1.1.2 儀器設備與試劑

捕蟲網、三角紙袋、體視顯微鏡、解剖鏡、酒精燈、試管、鐵架臺、試管夾、10%KOH溶液、75%酒精、木餾油、丁香油、加拿大樹膠、PCR儀；電泳儀；凝膠成像儀等。

1.2 方 法

1.2.1 標本采集與前期處理

通過捕蟲網采集到蝴蝶后，用雙手捏蝴蝶翅基部使其失去飛行能力，將蝴蝶裝至三角袋臨時保存至蝴蝶死亡后利用昆蟲針三角片和展翅板進行展翅，放在通風處使其干燥，附上標簽后收入標本盒保存。

1.2.2 雄性外生殖器標本的制作、觀察及保存

將艾弗斯曼多眼蝶標本編號1，2，3，剪下腹部末端1/3處(一般蝶類雄性外生殖器位于第9～10腹節)剪下放置于試管中，加入約試管1/5容積的10%KOH溶液，將試管放置于酒精燈上均勻加熱直至溶液沸騰后保持7～8 min以溶解其肌肉組織，待溶液冷卻后用鑷子取出腹部置于75%酒精溶液中，在解剖鏡下用解剖針取出雄性外生殖器，用75%的酒精反復清洗去除附著于雄性外生殖器的透明絮狀物[12,20]。使用體視顯微鏡觀察洗凈的雄性外生殖器并進行不同角度的拍照，之后在75%酒精中拆除雄性外生殖器，觀察并拍攝各個結構。表1

永久保存，需將解剖處理后的雄性外生殖器置于木餾油中脫水20～25 min，之后取出置于丁香油中，待置于載玻片上吸干多余的丁香油用蓋玻片固定，用加拿大樹膠封片，最后將載玻片移入35℃的恒溫箱中烘干3～4 d后附上標簽放入切片盒中保存。

1.2.3 DNA 的提取

將艾弗斯曼多眼蝶剩余腹部組織分別剪下于干凈離心管中研磨編號1，2，3，利用按照凱杰(QIAGEN)公司生產的血液/組織基因組DNA提取試劑盒說明書操作提取艾弗斯曼多眼蝶DNA。

1.2.4 目的片段擴增、檢測及測序

選用線粒體基因細胞色素氧化酶I(COI)的部分片段作為分子標記，選用擴增該片段的通用引物LCO1490/HCO2198作為引物，上游引物堿基序列：5’-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’,下游引物堿基序列：5’-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。

PCR反應體系總體積為20 μL；上、下游引物各0.5 μL(引物濃度10 μmol/ L)，2×PCRMix預混液10 μL，DNA模板5 μL，用滅菌雙蒸水補足體積至20 μL。擴增程序：95℃ 5 min，94℃50s，45～50℃退火，72℃50s，35℃循環，72℃10 min，4℃保存，PCR產物均用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，電壓110V 20 min，待電泳結束后，將瓊脂糖凝膠置于凝膠成像系統的紫外燈下觀察，并拍照。利用純化試劑盒將目的片段電泳條帶單一且明亮的PCR產物再次純化。委托上海生工生物工程股份有限公司進行PCR產物雙向測序。

1.2.5 目的序列拼接與確認

利用DNAStar7.1.0的SeqMan Pro軟件查看序列峰圖質量并進行人工校對，將校對后的正、反向序列進行序列拼接。將拼接好的艾弗斯曼多眼蝶COI基因序列分別與GenBank數據庫數據進行同源性比對與分析，進一步確認測定的目標序列來自多眼蝶屬昆蟲，排除因試驗污染而導致測序結果不準確。

2 結果與分析

2.1 艾弗斯曼多眼蝶雄蟲翅面特征

研究表明，翅正面呈黃褐色，前后翅外緣呈黑色。前翅亞頂區有3個黑斑，中區具1個黑斑；后翅亞外緣區有1列黑圓斑。前翅反面中室有4條黑色豎紋，后翅反面中區到基區為黑褐色。前緣中區斑紋外帶白色，亞外緣區有6個黑色眼斑，黃眶白瞳。圖1

注：A：背面觀；B：腹面觀

2.2 艾弗斯曼多眼蝶雄性外生殖器結構特征

研究表明，與鱗翅目大多數種類一樣，艾弗斯曼多眼蝶的雄性外生殖器由第9、10腹節特化而成，基本結構主要由背兜 (tegumen)、基腹弧(vinculum)、陽莖(aedeagus)、鉤形突(uncus)、陽莖軛片(juxta)、囊形突(saccus) 、抱器瓣(valvae)等幾部分構成?；够l狀呈U型結構；背兜較寬為馬鞍狀，腹面光滑；囊形突為頭粗尾細的管狀突起，長寬比約為2∶1；抱器瓣為扁平囊狀，基部開口，抱器端圓滑，外緣外側著生密集而整齊的剛毛(圖3B，C)；鉤形突為末端尖鉤狀結構，呈三角形，兩側外緣平滑；陽莖為棒狀，表面粗糙近透明段部位斜截式開口(圖3D)；陽莖軛片為盾狀結構，正面呈U型。圖2，圖3

注：tg：背兜；vin：基腹??；ae：陽莖；un：鉤形突；jx：陽莖軛片；sa：囊形突； vla：抱器瓣

注：A：基腹弧將背兜與囊形突相連；B-C：抱器瓣側面觀；D：陽莖

2.3 艾弗斯曼多眼蝶COI基因條形碼

研究表明，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測試驗選取的艾弗斯曼多眼蝶COI基因PCR擴增產物。其中1～3條帶為1號樣本，4～6條帶為2號樣本，7～9條帶為3號樣本。1，2號樣本條帶亮度強且單一，3號條帶亮度一般，均無其他干擾帶。圖4

圖4 艾弗斯曼多眼蝶COI基因PCR產物電泳圖Fig.4 Electrophoresis of COI gene PCR products of Kirinia eversmanni

2.4 艾弗斯曼多眼蝶基因組序列

研究表明，3頭艾弗斯曼多眼蝶的基因序列相似性達到100%，其片段大小為696 bp，堿基平均含量分別為：A30%、C15%、G15%及T41%；序列中G+C含量為30%，A+T含量為71%，表現出明顯的A/T偏向性。通過與NCBI數據庫進行比對，發現所獲得的基因序列與數據庫所記錄物種Kiriniaeversmanni(登入號：FJ663540.1)的COI基因長度相同且相似度高達99.70%，僅有部分單個堿基存在差異，說明試驗所獲得的基因片段與數據庫中所記錄種為同一物種。圖5，圖6

圖5 3頭艾弗斯曼多眼蝶的COI基因序列對比Fig.5 COI gene sequence comparison between three Kirinia eversmanni

圖6 試驗樣本COI基因與NCBI中艾弗斯曼多眼蝶序列比對Fig.6 Comparison results between the COI gene of the experimental sample and the sequence of Kirinia eversmanni in NCBI

艾弗斯曼多眼蝶翅面正面呈黃褐色，前后翅外緣呈黑色，前翅亞頂區有3個黑斑，中區具1個黑斑，后翅反面中區到基區為黑褐色；雄性外生殖器囊形突為頭粗尾細的管狀突起，長寬比約為2∶1，抱器瓣抱器端圓滑，外緣外側著生密集而整齊的剛毛，鉤形突為末端尖鉤狀結構，呈三角形，陽莖為棒狀，盲囊端無彎曲；COI基因序列長度為696 bp，表現出明顯的A/T偏向性。

3 討 論

3.1 艾弗斯曼多眼蝶的準確鑒定

研究中，DNA條形碼與雄性外生殖器特征相結合，準確鑒定了中國新紀錄種艾弗斯曼多眼蝶并對翅面特征進行完整描述。胡曉雯、劉德星等[20-21]利用DNA條形碼技術與外生殖器特征鑒定相結合分別對8種蛾類和國內新紀錄種澳洲麻蠅(Sarcophagaaustralis)進行快速、準確的鑒定。與前人不同，研究中對物種成蟲翅面特征進行了描述，一方面豐富了艾弗斯曼多眼蝶的紀錄情況，另一方面也對今后學者對艾弗斯曼多眼蝶的研究奠定基礎提供便利。

國內外有關多眼蝶屬的研究極少，而關于艾弗斯曼多眼蝶，僅有Vladimir等[6]在研究隨著地理區域覆蓋范圍擴大DNA條形碼是否仍然是一個有效的識別工具時，選擇了艾弗斯曼多眼蝶作為研究對象之一，并將艾弗斯曼多眼蝶的DNA條形碼上傳至NCBI數據庫。研究中得到的艾弗斯曼多眼蝶的COI基因序列與Vladimir的結果比對相吻合，豐富了國內艾弗斯曼多眼蝶的DNA條形碼記錄信息。

在對艾弗斯曼多眼蝶雄性外生殖器進行解剖過程中，易對外生殖器官結構造成損傷，但可以直觀展現其雄性外生殖器結構，便于描述及研究借鑒引用。利用DNA條形碼技術對艾弗斯曼多眼蝶進行鑒定，試驗操作流程簡單方便，對于標本完整度的要求小于傳統形態學分類，效率高，結果準確性高。結合翅面特征的描述，準確的對艾弗斯曼多眼蝶進行描述鑒定，彌補了國內關于該物種記錄的空白，同時在形態及分子鑒定層面給出鑒定依據。

3.2 DNA條形碼技術的應用

DNA條形碼技術在鱗翅目昆蟲的分類鑒定過程中運用最為廣泛。國內外關于鱗翅目昆蟲DNA條形碼的研究，極大的推動了DNA條形碼技術的發展，使其逐步成為高效的物種鑒定工具。在研究中，基于艾弗斯曼多眼蝶線粒體COI基因與NCBI中已記錄的基因序列對比結果，結合近年來在物種鑒定及系統發育的相關研究，相較于DNA條形碼技術剛提出時引起的爭議，在今天該技術已取得了較好的效果。但目前已登錄至GenBank系統中用于鑒定的COI序列有限，也為該技術帶來了一定的局限性。已有研究嘗試將ITS、Cytb等多基因片段用于DNA條形碼鑒定中，并取得較好效果。黃蓬英等[22]利用ITS1和ITS2序列成功對刺桐姬小蜂(Quadrastichuserythrinae)進行快速分子鑒定；王利華等[23]利用COI與Cytb基因片段對6種鲌屬魚類進行有效區分，COI序列和Cytb序列相結合進行物種鑒定的可行性；陳光輝[24]利用ITS1、ITS2、Cytb、COI、COII5種基因片段成功鑒定玉米象Sitophiluszeamais。同時DNA條形碼技術在物種的不同發育階段的基因條形碼識別、物種的系統發育分析等方面也有很大的研究前景。陳珊等[25]選取巨癤蝙蛾(Endoclitadavidi)的成蟲、卵、幼蟲、蛹不同時期的COI基因片段進行測序比對，并選取NCBI 中記錄的6 種蝙蝠蛾科蛾類以鄰接法(neighbor-joining，NJ)和最大簡約法(maximumparsimony，MP)2種方法構建系統發育樹，聚類分析與形態學鑒定結果均一致。

形態學鑒定過程中對分類學家的知識和經驗依賴性很強，對標本外部形態特征的完整性要求很高，而DNA條形碼技術操作簡單高效，這便使得形態學發展面臨巨大挑戰。雖然DNA條形碼技術相較于傳統形態學分類存在較多優點并且有一定的應用前景[26]，但其并不能取代傳統分類方法，在分類鑒定中，仍需綜合形態學特征來確保鑒定的準確性，二者相輔相成，保持相互補充的關系。通過DNA條形碼技術可以直接鑒定至種級水平，但單純依據分子鑒定仍存有局限性，有些物種進化時間較短，表現出較小的種間遺傳距離以及物種基因雜交等情況均會出現，實際鑒定中，不能僅僅依據分子數據，脫離形態學鑒定的復核確認[27,28]。傳統的形態學鑒定作為昆蟲鑒定的經典方法仍不失為在物種鑒定過程中的重要手段之一，在集形態分子為一體的整合分類法也會使得物種鑒定更為科學和準確。

4 結 論

獲得的艾弗斯曼多眼蝶的COI基因序列與NCBI數據庫中已記錄物種Kiriniaeversmanni對比，二者為同一物種。在DNA條形碼技術的基礎上，結合艾弗斯曼多眼蝶翅面特征及雄外生殖器的形態描述，對艾弗斯曼多眼蝶進行了準確的鑒定，確定其為中國新紀錄種。