改良麥康凱平板篩查腸道定植耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌的性能評價*

康佳，趙志軍，李剛，茆永娟，楊紅，周云花，潘亞菲，賈偉

(1.寧夏醫科大學臨床醫學院，銀川 750004；2.寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心，銀川750004；3.寧夏臨床病原微生物重點實驗室，銀川750004)

人體腸道是致病菌的天然儲存庫，攜帶碳青霉烯酶編碼基因菌株易導致耐藥基因在腸道細菌之間傳遞[1]，使耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌(carbapenem-resistant Enterobacteriaceae，CRE)腸道定植越來越普遍。研究表明，CRE定植會增加患者感染CRE的風險，造成患者死亡率升高[2]。因此，對于入院患者，尤其是重癥患者進行腸道定植CRE篩查尤為重要。目前，國際上對CRE的篩查方法尚無統一標準，主要有美國疾病控制與預防中心(Centers for Disease Control and Prevention，CDC)推薦的肉湯增菌法、商品化顯色培養基、PCR方法等，但以上方法仍存在操作繁瑣、檢測周期長、檢測成本高等問題。因此，有必要建立一種敏感性和特異性高、操作簡便且適合推廣使用的腸道定植CRE篩查方法。本實驗通過在麥康凱培養基中分別加入3種不同碳青霉烯類藥物制成改良平板，用CRE菌株和非CRE菌株檢測其敏感性、特異性和最低檢測限；通過臨床糞便樣本驗證平板篩查性能，并與肉湯增菌法及CHROMagar KPC顯色培養基進行對比評價。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集2019年1—12月寧夏醫科大學總醫院臨床連續分離45株CRE菌株(包括肺炎克雷伯菌21株、大腸埃希菌12株、陰溝腸桿菌10株、產酸克雷伯菌1株和弗勞地檸檬酸桿菌1株)和30株非CRE菌株(包括肺炎克雷伯菌12株、大腸埃希菌10株、陰溝腸桿菌8株)，其中收集于2019年6—12月的20株CRE(包括肺炎克雷伯菌10株、大腸埃希菌4株、陰溝腸桿菌6株)用于最低檢測限評估。同時收集2019年11—12月重癥監護室患者非重復糞便樣本142份。CRE判定標準：依據美國CDC發布的CRE指南[3]，亞胺培南或美羅培南最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)≥4 μg/mL和(或)厄他培南MIC≥2 μg/mL(微量肉湯稀釋法)。經測序證實產KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌臨床分離菌為寧夏醫科大學總醫院醫學實驗中心保存，大腸埃希菌ATCC 25922購自北京百歐博偉生物技術公司。

1.2主要試劑與儀器 Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)、DL 2000 DNA marker(TaKaRa公司)；瓊脂糖(西班牙BIOWEST公司)；麥康凱瓊脂培養基干粉、M-H(B)培養基干粉(北京索萊寶公司)；亞胺培南藥粉、美羅培南藥粉、厄他培南藥粉(>95%BR，大連美侖公司)；胰蛋白酶大豆肉湯(TSB)培養基、10 μg美羅培南藥敏紙片(英國Oxoid公司)；CHROMagar KPC顯色培養基(法國科瑪嘉公司)；M-H固體培養基(鄭州安圖生物公司)；一次性培養皿(浙江拱東公司)；恒溫培養箱(上海力申公司)；Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定系統及配套AST-GN04藥敏卡、MALDI-TOF MS儀、麥氏比濁儀(法國生物梅里埃公司)；PCR擴增儀、電泳儀、凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3PCR法檢測耐藥基因 煮沸法提取DNA，采用PCR法檢測CRE相關耐藥基因(TEM、SHV、NDM、KPC、OXA-48、VIM、IMP)，引物設計參考文獻[4]。反應體系50 μL：Premix TaqTM25 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水 22 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55～57 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30個循環；72 ℃ 5 min。引物序列及退火溫度見表1。引物合成及PCR產物測序均由上海生工生物工程公司完成，測序結果與GenBank中原序列進行比對鑒定。

表1 耐藥基因引物序列、產物長度和退火溫度

1.4改良麥康凱平板、CHROMagar KPC顯色培養平板的制備及結果判讀 分別稱取3.3 g CHROMagar KPC顯色培養基干粉及51.5 g麥康凱瓊脂干粉，各溶解于1 000 mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15 min。待培養基冷卻至45～50 ℃時，向CHROMagar KPC顯色培養基中加入0.4 g增補劑(試劑自帶)，同時依據CLSI M100第30版[5]腸桿菌科關于各藥物耐藥的MIC折點，向麥康凱培養基中分別加入3種碳青霉烯類藥物(終濃度為亞胺培南4 μg/mL、美羅培南4 μg/mL、厄他培南2 μg/mL)。輕輕搖動錐形瓶，混勻后立即傾注25 mL至90 mm平皿中，凝固后備用。標本接種于改良麥康凱平板35 ℃培養16～18 h后菌落經Vitek 2 Compact全自動細菌鑒定系統及配套AST-GN04藥敏卡鑒定為腸桿菌科細菌且亞胺培南或美羅培南MIC≥4 μg/mL和(或)厄他培南MIC≥2 μg/mL則判定為CRE[3]。標本接種CHROMagar KPC顯色培養基35 ℃培養16～18 h后菌落呈暗粉紅色到紅色菌落為碳青霉烯類耐藥大腸埃希菌，菌落呈深藍色則為碳青霉烯類耐藥克雷伯菌屬、腸桿菌屬、枸櫞酸桿菌。

1.5肉湯增菌法 根據CRE指南[3]，制備100 μL糞便懸液(每毫升生理鹽水約0.5 g糞便)，將其加入含有一片10 μg美羅培南藥敏紙片的5 mL TSB培養基中。置于35 ℃培養16～18 h后吸取100 μL培養液移種至普通麥康凱平板上，過夜培養。挑取乳糖發酵的菌落用Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀及配套AST-GN04藥敏卡進行菌株鑒定和藥物敏感性試驗。

1.6微量肉湯稀釋法 根據藥物的理化性質及使用說明將亞胺培南和美羅培南分別配制成終濃度為2 560 μg/mL的藥物儲存液，在96孔板中連續倍比稀釋后得到一系列100 μL藥物梯度稀釋液(藥物濃度范圍為0.125～256 μg/mL)。將待測菌經M-H瓊脂平板35 ℃過夜培養后配制成0.5麥氏濁度的菌懸液，稀釋100倍后取100 μL菌懸液分別接種于含100 μL藥物的小孔中。陰性對照孔加入200 μL菌懸液，空白對照孔加入200 μL M-H肉湯培養基。將接種好的96孔板置于35 ℃恒溫培養箱24 h后觀察細菌，將菌體生長量約80%被抑制判為終點孔。質控菌株：大腸埃希菌ATCC 25922，結果解釋參照CLSI文件[5]。

1.7敏感性與特異性檢測 菌株經血平板復蘇后，分別接種于3種不同抗菌藥物的改良麥康凱平板，置于35 ℃培養16～18 h，觀察是否長出菌落。經測序證實產KPC型碳青霉烯酶肺炎克雷伯菌為陽性質控，大腸埃希菌ATCC 25922為陰性質控。

1.8最低檢測限的評估 選取20株CRE臨床菌株經接種血平板復蘇后，用生理鹽水配置成0.5麥氏濁度單位菌懸液，并進行101～106倍比稀釋，制成102～108CFU/mL菌懸液，取不同濃度的菌懸液10 μL分別接種于3種不同抗菌藥物的改良麥康凱平板，置35 ℃培養16～18 h，觀察是否長出菌落，所有菌株重復檢測3次。

1.9臨床樣本的性能驗證 將142份糞便樣本分別用肉湯增菌法、CHROMagar KPC顯色培養基以及改良麥康凱平板3種方法接種，置于35 ℃培養16～18 h，觀察是否生長菌落。將長出的菌落分離純化后用Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀進行菌株鑒定和藥物敏感性試驗，并用MALDI-TOF MS及微量肉湯稀釋法復核最終結果。藥敏試驗操作方法及結果解釋參照CLSI標準[5]。

1.10統計學分析 用SPSS 26.0軟件進行。計數資料用例數表示，方法間篩查結果的一致性采用Kappa一致性檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1PCR結果 45株CRE中僅檢出1種耐藥基因15株，檢出2種耐藥基因25株，另外5株檢出3種耐藥基因。TEM、SHV檢出率分別為62.22%(28/45)和24.44%(11/45)，NDM、KPC、OXA-48的檢出率分別為62.22%(28/45)、15.56%(7/45)和13.33%(6/45)，未檢出IMP及VIM。見表2。

表2 45株CRE的耐藥基因結果

2.2改良麥康凱平板檢測CRE的敏感性及特異性 45株CRE中，亞胺培南改良麥康凱平板上有1株攜帶blaTEM大腸埃希菌未生長；美羅培南改良麥康凱平板上有2株未生長，分別為攜帶blaTEM大腸埃希菌和blaKPC肺炎克雷伯菌；45株CRE均在厄他培南改良麥康凱平板上生長。30株非CRE菌株，除2株肺炎克雷伯菌在厄他培南改良麥康凱平板上生長外，其余菌株均不生長。亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良麥康凱平板分別檢出44株、43株和45株CRE，敏感性分別為97.78%(44/45)、95.56%(43/45)和100%(45/45)；亞胺培南與美羅培南改良平板特異性均為100%(30/30)，厄他培南為93.33%(28/30)；美羅培南與亞胺培南改良平板陽性預測值一致，為100%，厄他培南為95.74%；陰性預測值由高到低分別為厄他培南改良平板(100%)、亞胺培南改良平板(96.77%)和美羅培南改良平板(93.75%)。

2.3改良麥康凱平板最低檢測限評估 20株CRE中，接種菌液濃度為108CFU/mL時，亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良平板上分別有14株、13株、20株生長，檢出率分別為70%(14/20)、65%(13/20)和100%(20/20)；接種菌液濃度為107CFU/mL時，亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良平板上分別有11株、10株、20株生長，檢出率分別為55%(11/20)、50%(10/20)和100%(20/20)；接種菌液濃度為106CFU/mL時，亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良平板上分別有8株、7株、20株生長，檢出率分別為40%(8/20)、35%(7/20)和100%(20/20)；接種菌液濃度為105CFU/mL時，亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良平板上分別有3株、5株、19株生長，檢出率分別為15%(3/20)、25%(5/20)和95%(19/20)；接種菌液濃度為104CFU/mL時，亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良平板上分別有2株、2株、19株生長，檢出率分別為10%(2/20)、10%(2/20)和95%(19/20)。見表3。

表3 3種改良麥康凱平板最低檢測限評估

2.43種方法從糞便中篩查CRE能力的比較 經確認，142份糞便樣本中，共有5株CRE，包括4株大腸埃希菌及1株肺炎克雷伯菌。肉湯增菌法共檢測出7株菌，其中包括5株CRE(大腸埃希菌4株，肺炎克雷伯菌1株)及2株非CRE(碳青霉烯類敏感的大腸埃希菌和惡臭假單胞菌各1株)；CHROMagar KPC顯色培養基檢測出5株CRE(大腸埃希菌4株，肺炎克雷伯菌1株)和1株惡臭假單胞菌；亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良麥康凱培養分別檢出3株CRE(大腸埃希菌)、2株CRE(大腸埃希菌)、4株CRE(大腸埃希菌3株，肺炎克雷伯菌1株)，均未檢出非CRE菌株。

肉湯增菌法與CHROMagar KPC顯色培養基篩查結果差異無統計學意義(P>0.05，Kappa=0.919)；3種改良麥康凱平板與肉湯增菌法篩查結果均一致，差異無統計學意義(P>0.05)，厄他培南改良麥康凱平板與其一致性(Kappa=0.717)高于亞胺培南(Kappa=0.588)與美羅培南(Kappa=0.563)；3種改良麥康凱平板與CHROMagar KPC顯色培養基篩查結果均一致，差異無統計學意義(P>0.05)，厄他培南改良麥康凱平板與其一致性(Kappa=0.885)大于亞胺培南(Kappa=0.657)及美羅培南(Kappa=0.489)。

3 討論

本研究建立一種基于改良麥康凱平板的快速篩查CRE的方法，同時利用臨床菌株及糞便樣本評價其檢測性能。結果顯示，亞胺培南、美羅培南和厄他培南改良平板特異性分別為100%、100%和93.33%，敏感性分別為97.78%、95.56%和100%。本實驗中發現4株僅檢測出blaTEM的大腸埃希菌中有1株未在亞胺培南改良麥康凱平板上生長，其他3株卻可以生長。目前已報道的CRE相關耐藥基因有很多種[6]，而本研究只檢測了其中7種，該菌株是否攜帶其他耐藥基因或由其他耐藥機制造成還未可知。有文獻報道，碳青霉烯酶濃度[7]、亞型及相關β-內酰胺酶基因的表達差異[8]均會影響藥物抑菌效果，這可能會導致攜帶不同耐藥基因的同種菌株在3種藥物改良平板上生長狀況不同。用20株CRE評估3種不同藥物改良平板最低檢測限時發現：不同菌株或不同基因型的相同菌株在同種藥物改良平板上生長的最低檢測限略有差異，亞胺培南、美羅培南改良麥康凱平板最低檢測限大多分布在105～108CFU/mL接種水平，而厄他培南改良麥康凱平板最低檢測限集中分布于102～103CFU/mL?？梢?，厄他培南改良平板最低檢測限優于亞胺培南及美羅培南改良平板。陳善建等[9]以KPC型CRE為主評估亞胺培南、美羅培南、厄他培南改良法國科瑪嘉尿路顯色培養基最低檢測限，也發現厄他培南平板具有更低的檢測限。Ramachandran等[10]從藥物結構及分子動力學的角度闡釋了這3種碳青霉烯類藥物抑菌效果存在差異的原因，并表明相較于厄他培南，美羅培南和亞胺培南治療細菌感染效果更好，這也為本實驗中厄他培南改良平板上菌株更易生長提供了理論依據。

本研究中的3種碳青霉烯類藥物改良麥康凱平板與肉湯增菌法及CHROMagar KPC培養基在篩查腸道定植CRE方面均具有一致性，尤其以厄他培南平板一致性更好。肉湯增菌法雖為美國CDC推薦篩查方法，但其操作復雜、檢測周期較長，不適用于大量篩查。而商品化的CHROMagar KPC培養基由于價格昂貴，臨床難以大規模推廣。在現有報道中，鮮有評價自制平板性能并采用臨床標本驗證，且與肉湯增菌法及商品化方法的結果進行一致性評價報道。本實驗后期仍需增加樣本數量及類型進一步驗證其篩查性能。