微塑料對大型溞的急性毒性研究

李 勤 李尚諭 熊 雄 張榜軍 劉 洋,

(1.河南師范大學生命科學學院, 新鄉 453007; 2.中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072;3.河南師范大學學報編輯部, 新鄉 453007)

微塑料是指粒徑從幾微米到幾毫米、形狀不一的塑料混合體的總稱, 定義為小于5 mm的塑料,其形狀有碎片、纖維、顆粒和小球等多種, 分為初級塑料和次級塑料[1]。近年來, 我國塑料制品的產值逐年增高, 主要組成成分為聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚乳酸(PLA)及聚對苯二甲酸乙二酯(PET)等聚合物[2]。塑料制品在生產過程中往往會添加大量的阻燃劑、塑化劑等助劑, 部分P V C 含有鄰苯二甲酸酯(PAEs)。PAEs 及其代謝產物屬于環境內分泌干擾物, 對人體有生殖發育的影響、胚胎毒性和致癌毒性。如鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二己酯(DEHP)具有致癌性。PVC 中含有氯化氫, 這些物質會隨著聚氯乙烯的老化逐漸釋放到環境中[3,4]。有研究表明, 接觸高濃度PVC中的氯乙烯單體的工人易患肝癌等病癥; PVC中的氯乙烯可能導致人體先天缺陷、遺傳變化、皮膚病和消化不良等[5,6]。

研究表明, 多種藻類、貝類、魚類及海洋哺乳類動物都直接或間接地受到微塑料的影響, 微塑料多變的形狀和類型, 對海洋中不同的生物可產生不同的毒性作用[7]。海洋微藻中肋骨條藻(Skeletonema costatum)經96h平均直徑1 μm微塑料暴露后,其生長表現出抑制效應; 當濃度為50 mg/L時, 其葉綠素含量和光合效率顯著降低[8]。PVC濃度為250 mg/L, 淡水小球藻葉綠素a含量下降55.23%; 在此劑量下蛋白核小球(Chlorella pyrenoidosa)和水華微囊藻(Microcystis flos-aquae)的光合作用都受到抑制[9]。納米塑料珠阻礙小球藻和柵藻的光合作用, 可導致藻類ROS的產生[10]。斑馬魚攝入聚苯乙烯顆粒(20—1000 nm粒徑), 腮細胞的DNA有輕微的損傷;而虹鱒的鰓因微塑料顆粒的附著出現免疫反應[11,12];苯乙烯影響網紋蚤(Ceriodaphnia dubia)的繁殖率[13]。微塑料在遷移過程中可能富集重金屬和其他污染物, 對水生生物產生復合污染毒性, 進而對人類健康造成威脅[14]。

目前微塑料的毒性和影響研究多集中在海洋領域, 淡水領域報道較少。我國淡水水體比如太湖、武漢城市水體、珠江支流、上海城市河道、洞庭湖和洪湖等都檢測到微塑料, 其中微塑料豐度最高的是三峽水庫(表層水), 達1.36×107個/km2[15]。微塑料對淡水生物的影響研究不容忽視, 因此, 本研究主要探討微塑料對淡水生物的生長、繁殖及恢復后的影響效應。大型溞(Daphnia magna)屬于節肢動物門、甲殼綱和枝角類, 在淡水生態系統的物質循環和能量流動的環節中起到重要作用, 由于其對毒物敏感性較高, 被廣泛用于化學產品的毒性評價、水污染的檢測及制定各種水質標準實驗[16]。本實驗通過研究微塑料(800目的PVC)暴露后對大型溞的急性毒性、生長、繁殖及清水恢復實驗, 為微塑料(PVC)短期對淡水生物(大型溞)的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大型溞和小球藻(Chlorella vulgaris)來自中國科學院水生生物研究所。大型溞養殖在直徑為20 cm的圓形透明的玻璃缸中, 置于光暗比(L∶D)16∶8的光照培養箱中, 光照強度為3000 lx, 溫度為(24±1)℃,每天上午10點喂食小球藻, 用曝氣2d以上的自來水培養。毒性試驗前24h挑選懷卵的生命力強的母溞單獨培養, 其敏感度測定符合國際標準。選用800目(15 μm)的PVC, 購自東莞市靜天塑膠原料有限公司。

1.2 幼溞的急性毒性

參考OECD[17]等方法, 根據預實驗, 將經過超聲波水浴40min 的400 mg/L的PVC懸浮液, 依次稀釋0、12.5、25、50、100、200 和400 mg/L的梯度,記為CK、A、B、C、D、E、F組。設置4個重復,每個燒杯中放入5只6—24h經過饑餓處理的幼溞,在24h、48h、72h和96h記錄幼溞的死亡率。實驗過程中不喂食, 不換液。

1.3 心率測定

經過96h的急性毒性處理, 使用體式顯微鏡(SZ61, 奧林巴斯, 日本)對每組隨機選擇2只的大型溞進行60s左右的錄像, 然后使用計數器對錄像結果進行大型溞跳動次數的計數, 每個視頻計數3次,計算結果換算成“次/min”[18,19]。

1.4 攝食率測定

參考賈靜[20]方法, 96h的急性毒性處理后, 將其轉到含有小球藻的培養液中, 利用血球計數板計數的方法測定小球藻密度。小球藻初始密度為5×105cells/mL, 黑暗下靜態放置培養箱5h后計數小球藻的密度。參考羅艷蕊等[21]方法, 計算攝食率(I):

式中,I為攝食率, 平均每個大型溞單位時間內攝取的藻細胞數量, 單位為cells/h;C0為藻液的初始密度, 單位為cells/mL;Ct為藻液的最終密度, 單位為cells/mL;t為時間, 單位為h;A為校正因子。

1.5 酶活測定

參考張楠等[22]方法, 將6—24h 幼溞置于不同濃度組(0、25、50、100和200 mg/L)處理96h。試驗期間不喂食, 不換試驗用液。96h 后將大型溞濾出,同時棄去死亡個體。用86%的生理鹽水, 沖洗3 次,在濾紙上吸干水分后稱重, 將大型溞以1 g∶9 mL 的比例添加86%的生理鹽水, 置冰中用勻漿器勻漿,勻漿多次。勻漿之后以10000 r/min 4℃下離心10 min,收集上清液, 分裝后-80℃冰箱保存備用。采用試劑盒法(南京建成生物工程研究所)測SOD(超氧化物歧化酶)活性、GSH(谷胱甘肽過氧化酶)活性、組織中蛋白質含量。

1.6 恢復試驗

在96h急性毒性處理后, 將其轉入含有藻液(小球藻)的50 mL燒杯中。每個燒杯中放1只溞, 每天加定量的藻液, 每隔1天換1次水, 每天記錄脫殼數、死亡數、產幼溞情況。測量首次產幼溞體長及21d母溞體長。

1.7 PVC排出試驗

96h急性毒性處理后, 將其轉入清水中。在顯微鏡下0、1h、4h和16h拍照, 觀察其清水排出PVC的過程。

1.8 數據處理

Excel進行數據整理和繪圖, SPSS17.0進行概率單位(Probit)回歸分析和單因素方差分析(One-way ANOVA); 當方差不具有齊性時, 選擇未假定方差齊性的Tamhane’s T2和Dunnett’s T3(3)檢驗。數據結果用平均值±標準差表示,P＜0.05為顯著性差異,P＜0.01表示極顯著性差異。

2 結果

2.1 PVC對大型溞的急性毒性及其心率和攝食率的影響

96hLC50值為130.132 mg/L, 95%置信區間為82.864—234.989 mg/L。通過觀察, 大型溞在24—48h時死亡率較低; 72—96h毒性上升。當濃度為400 mg/L時, 在96h幼溞全部死亡。

在圖1中96h時, 大型溞的心率隨著濃度的增加而下降。當處理組濃度為50、100和200 mg/L時,與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05); 但低濃度組(12.5和25 mg/L)與對照組相比, 心率無顯著性差異(P＞0.05)。當處理組為200 mg/L, 大型溞心率最低。這說明PVC濃度越大, 對其心率影響越大。

在圖2中, 大型溞的攝食率與對照組相比, 均低于對照組。當處理組濃度為12.5 mg/L時, 處理組與對照組的攝食率無明顯差異(P＞0.05)。當處理組濃度為200 mg/L時, 攝食率最小為(1.236×104±0.101) cells/(ind.·h), 與對照組的攝食率(1.772×104±0.040) cells/(ind.·h)相比, 具有極顯著性差異(P＜0.01)。

2.2 PVC對大型溞抗氧化酶的影響

圖1 PVC對大型溞96h心率的影響 (*代表P＜0.05, 下同)Fig.1 Effect of PVC on heart rates of D.magna (*means P＜0.05,the same applied below)

圖2 PVC對大型溞攝食率的影響 (**代表P＜0.01)Fig.2 Effect of PVC ingestion rate on D.magna (**means P＜0.01)

在圖3a中, 當處理組濃度為200 mg/L時, 蛋白含量最低為(0.228×103±0.080) mg/L; 處理組濃度為100和200 mg/L時, 與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05); 其他處理組與對照組相比, 沒有明顯的差異(P＞0.05)。圖3b中處理組中的GSH含量與對照組相比呈升高的趨勢; 處理組除了濃度為200 mg/L時, 與對照組相比有顯著性差異(P＜0.05), 其余各組均無顯著性差異(P＞0.05)。圖3c中處理組的SOD的活力與對照組相比, 基本隨濃度的增加而升高;處理組只有濃度為200 mg/L時, 與對照組相比具有顯著性差異(P＜0.05), 其他均不具有顯著性差異(P＞0.05)。這說明大型溞經過處理后, 體內酶發生相應變化, 出現氧化應激。

2.3 PVC對大型溞后續生長繁殖的影響

圖3 PVC對大型溞蛋白含量(a)、GSH含量(b)和SOD活力(c)的影響Fig.3 Effect of PVC on protein content (a), GSH content (b) and SOD activity (c) of D.magna (the same applied above)

表1中的處理組比對照組的首次產生溞時間早;總產幼溞數多, 但處理組(除了E組)的幼溞死亡數都高于對照組, 表2的處理組首次產幼溞體長均比對照組短, 而且部分子代有畸形; 處理組的21d母溞體長也比對照組短。

2.4 大型溞在不同時間排出PVC的情況

圖4中的處理組隨著在清水中恢復的時間延長, 大型溞的腸道逐漸干凈, 但到16h仍未全部排出。所有組清洗后轉入清水中進行拍照觀察, 所有處理組變化趨勢一致。E組在0時, 腸道都是白色;1h時, 大型溞周圍有白色絮狀物, 附肢上較多; 4h時,液體中有白色聚集體; 16h時, 大型溞的腸道內容物減少, 液體中有較多的白色聚集體。

3 討論

3.1 PVC對大型溞心率和攝食行為的影響

本文的急性毒性終點時間是96h, Rehse等[23]提出大型溞在1 μm不同濃度的PE暴露下, 24—72h的大型溞活動抑制結果低于96h的結果。機體對污染物早期的應激反應包括心率的變化, 本研究對心率進行了測定, 處理組的心率比對照組低, 表明暴露于PVC環境中的大型溞心率受到了影響。本研究心率數據比已有研究報道的心率低的原因可能是幼溞在試驗前進行了饑餓處理[19]。

攝食行為是水生動物的一項基本行為, 可以直觀地反映外界環境對其機體的影響[18]。Rist等[24]證明了大型溞暴露100 nm的塑料顆粒中, 攝食率下降21%。Ogonowski等[25]提出了大型溞因MPs的存在,攝食率下降30%。還有研究表明大型溞暴露PE中0.5h、1h和1.5h, 暴露組的攝食率與對照組的差異越來越小[20]。本研究結果表明, 大型溞在高濃度組PVC(25—200 mg/L)暴露96h時, 攝食率顯著受到抑制。PVC處理后的大型溞的攝食率下降, 可能是其在腸道內形成不規則的聚集體, 使腸道受到一定機械損傷[25], 與魚類攝入MPs阻塞消化道類似, 導致物理和機械損傷。MPs堵塞腸道和破壞腸道在動物的攝食和消化行為中較為常見的[26,27]。腸道中的微塑料可能誘導虛假的飽食感導致食物攝入量減少, 減少對微藻細胞的吸收和能量的攝入[28]。大型溞在饑餓的狀態下, 對食物無選擇性[29], 研究也發現處理組中的大型溞攝食PVC填滿腸道, 經過96h的短期暴露, 依舊影響大型溞在無PVC環境的攝食, 說明短期內(5h)無法改變PVC對大型溞攝食率的影響。

3.2 PVC對大型溞SOD和GSH的影響

生物體內抗氧化防御系統中重要的酶類包括SOD、過氧化氫酶(CAT)和GSH, 在應對外界損傷中起關鍵作用。SOD可以將轉化成H2O2和O2,減少體內的氧自由基, 阻止機體和細胞的氧化;CAT催化H2O2生成H2O和O2, 清除體內的過氧化氫;GSH催化過氧化物還原[30]。大型溞經過96h處理后,SOD和GSH都有不同程度的變化, 說明PVC處理后干擾了機體抗氧化防御系統穩態。當面對環境中PVC的脅迫時, 大型溞啟動抗氧化應激系統, 抵御不良環境, 從而維持自身抵抗外部環境改變的能力。

表1 21d大型溞恢復狀態的繁殖參數Tab.1 Reproductive parameters of 21d D.magna in restored state

表2 21d大型溞恢復狀態的生長參數Tab.2 Growth parameters of 21d D.magna in restored state

圖4 E組大型溞在不同時間排出PVC的情況Fig.4 The excretion of PVC from D.magna on E group at different times

3.3 PVC對大型溞繁殖的影響

水生生物攝入微塑料, 可以導致個體物理損傷、干擾其內分泌、抑制其生長發育、降低其生殖能力和引起氧化應激, 甚至增加其畸形率和死亡率[31]。處理組的子代數比對照組的多, 處理組子代體長及母溞體長均比對照組短, 子代有畸形, 表明短期的PVC暴露對大型溞后續的生長繁殖有不利影響。這與魚類攝入MP后, 影響其繁殖的觀點一致[27,30]。而部分研究發現大型溞暴露于63—75 μm的聚苯乙烯熒光顆粒中, 對其生存和繁殖沒有顯著影響[32]。這可能是微塑料材質和大小不同, 對大型溞的毒性不同。本實驗經過96h處理, 再進行21d的有藻恢復, 母溞仍存在死亡現象, 與大型溞暴露于PET(長62—1400 μm, 寬31—528 μm, 厚1—21.5 μm)48h后, 再進行24h無MPs有藻的培養基恢復實驗,結果較為類似[27]?？赡苁俏⑺芰蠈Υ笮蜏械膿p傷在一定時間內不可恢復。本實驗觀察到了幼溞出現尾刺彎曲和幼溞體長縮短的現象, 表明PVC暴露影響子代的形態發育。已有研究表明在Nano-PS暴露的大型溞表現出體型縮小和體重減輕的現象, 幼溞數量較少, 幼溞的畸形率上升至68%, 第二剛毛不完全發育和尾刺彎曲[33], 這些表明微塑料潛在地導致了大型溞子代畸形。在本試驗進行16h后, 大型溞腸道內容物仍未排除干凈。本研究結果與Rist等[24]關于大型溞攝食聚苯乙烯熒光顆(24h)結果較為一致。大型溞攝食微塑料后短時間內較難排凈,這可能是由于大型溞腸道攝食動態平衡及清水恢復時間有關[20,25], 而這部分研究仍需要進一步驗證。大型溞暴露96h后進行有藻恢復, 對子代仍會造成影響, 而究竟第幾代才能消除微塑料的影響,這部分研究還未見報道, 有待進一步研究。

4 結論

PVC暴露對大型溞的96hLC50值為130.132 mg/L,95%置信區間為82.864—234.989 mg/L。PVC高濃度處理組大型溞的攝食率與對照組有極顯著性差異(P＜0.01), 低濃度組卻無顯著性影響(P＞0.05)。暴露PVC后的大型溞比對照組心率低, PVC對大型溞心率有一定的影響。大型溞在16h內不能將腸道內的PVC全部排出。短期的PVC暴露影響大型溞的子代數及子代的形態發育, 這種影響需要大型溞長期的無暴露物的恢復。

致謝:

感謝中國科學院水生生物研究所的侯淼淼在實驗中給予的幫助, 感謝河南師范大學的劉夏楠、黃莉曉和黨步云對實驗的參與和幫助。