葡萄酒微生物污染形成的不良風味物質研究進展

姜文廣，趙虎，吳訓侖，牟玉柱，于政君，李記明

（煙臺張裕集團有限公司/山東省葡萄酒微生物發酵技術重點實驗室，山東煙臺 264001）

葡萄酒作為一種健康時尚的飲品，因其具有優雅怡人的香氣和鮮艷誘人的顏色，受到了眾多消費者的青睞，也逐步進入人們的日常生活中。葡萄酒香氣是葡萄酒質量的一個重要評價指標，其含量、比例以及平衡關系等構成了不同特色和風格的葡萄酒[1]。

但是許多葡萄酒在發酵、陳釀、灌裝及銷售環節中都有可能會遇到微生物的污染，形成一些不良氣味物質，使葡萄酒具有令人不悅的感覺[2]。目前已報道的葡萄酒中主要不良風味物質有幾十種，它們的感官閾值相差很大，從200 mg/L的醋酸到3 ng/L的2,4,6-三氯苯甲醚，這些異味物質來源于葡萄原料、葡萄酒發酵、儲存、裝瓶等不同生產環節，嚴重降低葡萄酒的品質，給葡萄酒商帶來較大經濟損失。

近年國內有關葡萄酒化學成分研究較多，主要集中于香氣、酚類等物質，有關葡萄酒中不良氣味物質的研究正逐步引起關注，如葡萄酒中揮發酚、軟木塞中TCA等[2-4]。而關于葡萄酒風味物質的研究起步較晚，尚缺乏對葡萄酒中異味物質的全面認識。對葡萄酒釀造生產中由微生物污染產生的不良風味物質的風味特征和主要防治措施進行系統梳理，以期為我國葡萄酒釀造生產提供借鑒。

1 微生物污染形成的主要不良氣味物質

目前葡萄酒生產過程中已知的由微生物污染形成的主要不良氣味物質主要有22種（表1）。其中，葡萄原料受到污染而產生的主要有6種，使葡萄酒呈現蘑菇或泥土味等；葡萄酒貯存中受到酒香酵母污染而產生的主要有5種，使葡萄酒具有馬廄味、酚味、烘烤味或餅干味等；葡萄酒發酵或貯存中受乳酸菌污染而產生的主要有6種，使葡萄酒呈現黃油味、餅干味或天竺葵氣味等；葡萄酒貯存中受醋酸菌污染而產生的主要有3種，使葡萄酒呈現醋酸味、煮水果味或膠水味等；另外，因橡木桶或木塞被真菌污染而產生的主要有4種，使葡萄酒呈現木塞味、濕抹布味或霉味等。

表1 葡萄酒中微生物污染形成的主要不良氣味物質Table 1 Main off-flavour compounds in wine formed by microbial contamination

2 葡萄原料污染帶來的不良氣味物質

葡萄腐爛是造成葡萄酒品質降低的重要因素，如酚類物質被多酚氧化酶破壞（漆酶）、香氣物質如單體萜烯類被轉化為無香氣物質、脂肪酸酯類物質被酯酶水解等[15-17]。

葡萄腐爛主要是由灰霉菌（Botrytis cinereas）引起，被污染的葡萄汁（葡萄酒）中具有蘑菇味、霉味、樟腦味、泥土味等感官缺陷，特別是在葡萄收獲期，遇降雨或冰雹災害等會加劇這些感官缺陷的出現[18-19]。

目前造成葡萄汁或葡萄酒中這種缺陷的物質已被證實，主要有1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、2-甲基異莰醇、土臭味素、葑酮、葑醇、2-辛烯-1-醇和2-庚醇等[18,20]。

2.1 蘑菇味物質

1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮具有典型蘑菇氣味，在葡萄酒中感官閾值較低，分別為40 μg/L和70 ng/L[5]。其中1-辛烯-3-醇可從葡萄汁遷移到葡萄酒中，是葡萄酒的蘑菇味香氣缺陷的主要來源。1-辛烯-3-酮在酒精發酵過程中往往會消失，對葡萄酒蘑菇氣味貢獻很小，但有時在‘赤霞珠’‘蛇龍珠’和‘黑比諾’等葡萄酒會檢測出來[18]。經研究證實，1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮主要是由灰霉菌生成[19]。此外，其他一些曲霉和青霉真菌如黑曲霉（AspergillussectionNigri）、短密青霉菌（Penicillium brevicompactum）、托姆青霉（Penicillium thomii）等也能夠生成1-辛烯-3-醇和1-辛烯-3-酮[18,20-23]。

2.2 土腥味物質

土臭味素、2-甲基異莰醇、葑酮和葑醇是葡萄汁和葡萄酒中泥土味、霉味和樟腦味等不良氣味的主要來源，這些氣味統稱土腥味。

在葡萄和葡萄酒中，土臭味素（二甲萘烷醇）被證實具有很強的泥土味，在含有部分腐爛葡萄的葡萄汁或葡萄酒中的含量均高于感官閾值。La Guerche等研究證實，在灰霉菌感染的葡萄中土臭味素來源于擴展青霉（Penicillium expansum）的代謝[24]。同時，Mattheis等認為米奇恩斯基青霉菌（Penicillium miczynskii）、嗜松青霉（Penicillium pinophilum）和肉青霉菌（Penicillium carneum）均具有生成土臭味素的能力[25]。

2-甲基異莰醇具有樟腦氣味，其在葡萄酒中感官閾值很低，與土臭味素接近。這種化合物在腐爛的葡萄或葡萄汁中經常被檢測出來，但在酒精發酵過程中會消失，在葡萄酒中很難檢測出來，因此對葡萄酒香氣基本無影響。另外，在被軟木塞污染的葡萄酒中有時也可檢測出來。2-甲基異莰醇是灰霉菌的一種代謝產物，同時一些青霉菌種和鏈霉菌種也發現具有生成該化合物的能力[22,26]。

葑酮和葑醇均具有泥土味，由于兩者的感官閾值均較高，分別為500 μg/L和50 μg/L，所以只有高濃度才能在葡萄汁或葡萄酒中感覺出來[27]。

因此，為避免葡萄酒中帶有上述不良氣味，應確保葡萄原料新鮮、健康、無病蟲害發生；在葡萄采收時注意避開陰雨天或清晨有露水時；葡萄采摘應選擇葡萄果實自身溫度較低時間，如在凌晨至上午；葡萄采摘后可灑干冰降溫或入冷庫低溫存放等；葡萄運輸到酒廠過程中避免擠壓破碎，盡可能做到采摘后幾小時內除梗破碎入罐等。

3 葡萄酒受酒香酵母污染生成的不良氣味物質

酒香酵母屬是一類在葡萄皮、葡萄酒以及發酵桶罐中普遍存在的酵母，它對葡萄酒的香氣具有一定貢獻，生成的糖苷酶可將葡萄汁或葡萄酒中不揮發的結合態糖苷鍵形式的風味前體化合物分解為游離態揮發的香氣物質，從而增加酒的香氣[28]。但是酒香酵母常被認為是降低葡萄酒感官品質的一種微生物，其產生的代謝產物對葡萄酒的色澤、風味、口感等方面有不利影響。如在葡萄酒釀造中，酒香酵母屬的代謝產物不只是這些香氣成分，同時也產生以4-乙基苯酚和4-乙基愈創木酚為典型代表的一類不良氣味（馬廄味、酚味等）[27-30]。另外，酒香酵母屬均具有生成2-乙基四氫吡啶和2-乙?；臍溥拎煞N具有“老鼠”異味（Mousy）化合物的能力，帶來令人不愉快感覺[31-32]。

酒香酵母對環境有著較強的耐受能力，使酒廠對酒香酵母的防控難度加大。生產車間的墻面、地面、儲酒容器、橡木桶及釀造設備等，均有可能感染酒香酵母。目前在葡萄酒的研究中發現諸多酒香酵母屬的種類，包括：Brettanomyces custersianus、B. naardenensis、B.nanus、B. anomalus、B. bruxellensi，B. intermediu等。還有，Walt提出一種具有產子囊孢子的酒香酵母屬，被稱為德克酵母屬（Dekkera）[2]。

從葡萄園到葡萄酒灌裝各環節都易受到酒香酵母屬的污染。一是葡萄園管理不到位，葡萄果實受到酒香酵母屬的侵襲；二是在葡萄酒釀造過程中，使用已經被酒香酵母屬污染的酒罐或設備，葡萄酒很容易被污染；三是酸度較低、pH高、多酚含量高的葡萄酒易受酒香酵母菌屬侵染，還有多年老橡木桶同樣是其生長繁殖的良好環境[33]。

因此，葡萄酒生產過程中需提高預防酒香酵母污染的意識，在確保貯酒容器及設備清潔衛生的情況下，及時調整葡萄酒的pH等指標，將葡萄酒中游離SO2的含量保持在30～40 mg/L，有利于酒香酵母的防控。同時，加強對葡萄酒貯存過程感官質量的監測。一旦發現存在酒香酵母污染問題，及時進行下膠過濾處理，去除酒香酵母，提升香氣潔凈度。另外，添加抑酒香酵母多糖，如Stab Micro（一種從黑曲霉中提取出的天然多糖）可以特異性地結合酵母的細胞壁，從而起到抑制酒香酵母的作用[34]。

3.1 馬廄味和藥味物質

4-乙基苯酚和4-乙基愈創木酚是存在于紅葡萄酒中的一類揮發性酚類物質。4-乙基苯酚通常被描述為草棚味、馬廄味，4-乙基愈創木酚則被描述為三葉草味、藥劑味，因它們的閾值較低（4-乙基苯酚430 μg/L、4-乙基愈創木酚33 μg/L）[8]，當酒香酵母產生的化學物質較少時，能增加葡萄酒的復雜度，帶來人們常說的雪松、泥土或者蘑菇的香氣，有些情況下，還會用動物野味來形容這種氣息。而當酒香酵母產生化學物質含量過高時，這些味道則會變成谷倉、牲畜棚、濕羊毛、濕狗等味道。

4-乙基苯酚和4-乙基愈創木酚的產生主要是因為酒香酵母使葡萄中的羥基苯丙烯酸脫羧生成4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈創木酚，隨后進一步被還原成4-乙基苯酚和4-乙基愈創木酚。

有關酒香酵母生物合成乙基酚的研究表明，有兩種酶在先后起主要作用。第一種酶是肉桂酸脫羧酶，將肉桂酸轉化為乙烯基酚；第二種是乙烯基酚還原酶。肉桂酸脫羧酶也存在于發酵使用的果膠酶中，目前果膠酶生產商中已意識到這一點，紛紛推出不含有肉桂?；ッ傅墓z酶產品[35]。

3.2 鼠味物質

在葡萄酒中經常會出現類似老鼠的異味，這種異味通常在葡萄酒咽下或吐出后，在口腔上顎會感覺出來，一旦感覺到這種氣味會持續超過10 min。但這種異味不能通過嗅聞感覺到，因為在葡萄酒的pH環境下這種異味不是完全揮發性的。在葡萄酒中出現老鼠味被認為最不能接受，目前尚無消除辦法[36]。

據研究證實，2-乙基四氫吡啶、2-乙?；臍溥拎ず?-乙?；量┦?種已知可產生老鼠異味的化合物[31-32]。在葡萄酒中，德克酵母屬/酒香酵母屬酵母已證實具有生成至少其中兩種物質的能力，而乳酸菌具有產生全部3種物質的能力。關于老鼠異味存在于部分葡萄酒中的原因現在還沒完全弄清楚，目前為止已被確定可能與這種異味形成有關的物質，如賴氨酸、鳥氨酸、金屬離子、溶氧等。德克酵母屬/酒香酵母屬酵母生成老鼠異味物質過程中，氧氣可能起到關鍵作用，因為除釀造過程接觸氧氣外，在少量氧氣條件下被德克酵母屬/酒香酵母屬酵母污染的葡萄酒不產生老鼠異味。

由于老鼠異味使人不愉快，檢測時不必品嘗葡萄酒。檢測方法主要有兩種[32]，一種是將酒滴到手背上摩擦，然后貼近皮膚嗅聞；第二種是在葡萄酒中滴加NaOH等堿性試劑，然后嗅聞。兩種方法都可以快速而有效的檢測出葡萄酒中的鼠味味。另外，通過氧化也可以檢測這種異味，即將葡萄酒暴露到空氣或氧氣中一段時間，然后嗅聞。

2-乙基四氫吡啶、2-乙?；臍溥拎じ髯约儤藴势肪哂泻婵練馕痘蝻灨蓺馕?。2-乙基四氫吡啶在葡萄酒中感官閾值為150 μg/L[8]，目前在葡萄酒中的含量均低于閾值，不是葡萄酒中老鼠異味的主要來源，因此關于2-乙基四氫吡啶的研究很少。但是已證實某些乳酸菌可生成162 μg/L 2-乙基四氫吡啶，使其成為一種潛在的老鼠異味貢獻物質[37]。

2-乙?；臍溥拎な且环N氧化不穩定化合物，在水中的感官閾值為2-乙基四氫吡啶的1%，約為1.6 μg/L[9]，而在葡萄酒中濃度為4.8～106 μg/L。2-乙?；臍溥拎ぞ哂袃煞N結構，即2-乙?；?3,4,5,6-四氫吡啶和2-乙?；?1,4,5,6-四氫吡啶。兩種異構體存在形式可能由pH決定，在葡萄酒酸性環境中以氨基態形式存在，而亞氨態形式具有老鼠異味。在葡萄酒中，較低pH環境有利于極性氨基形式，而口腔唾液中含有碳酸氫鈉，較溫和的環境，2-乙?；臍溥拎l生形式轉變，形成易揮發的亞氨態形式。這也可解釋為什么葡萄酒的鼠味嗅聞不出來，而在品嘗后能感覺出來。同樣將酒滴到手背上摩擦，然后貼近皮膚嗅聞或用堿液鑒定，也能證實這一點，因為與葡萄酒相比較，皮膚弱酸性，引起pH的改變；同樣，堿性溶液方法，也是通過氫氧化鈉溶液引起葡萄酒的快速堿化，使鼠味物質揮發出來。

因此，減少不良風味物質的產生，需控制發酵過程中酒香酵母生長繁殖的必要條件。例如，做好對設備、原材料的清洗和殺菌工作；不用已經被污染的酒桶；使用適量的SO2；酒桶滿罐裝酒；接種優質酵母菌菌種，從而減少B.bruxellensis生長繁殖的可能性等[38]。

4 葡萄酒乳酸菌污染生成的不良氣味物質

4.1 黃油味、餿飯味物質

2,3-丁二酮（雙乙酰）是葡萄酒中的一種風味物質。在葡萄酒中之所以能夠聞到、嘗到黃油的香味，主要取決于葡萄酒中雙乙酰含量，這種化學物質可以通過蘋-乳發酵得到。在這個過程中，發生轉變的是葡萄酒中口感尖酸的蘋果酸，產物是口感更柔順、帶有奶油香氣的乳酸（這種物質也存在于牛奶中）。蘋-乳發酵可以降低葡萄酒的酸度，豐富葡萄酒風味物質，同時還可以釋放一些二氧化碳氣體。另外，葡萄酒在橡木桶中的發酵過程也能夠使葡萄酒里有黃油的香味。大多數葡萄酒會在橡木桶中陳釀，隨著時間的推移，葡萄酒的口感將變得更加柔和，更加復雜。當葡萄酒中雙乙酰含量為4 mg/L以下時，可增加葡萄酒的口感及風味復雜性，帶來黃油（Butter）或奶酪（Cheese）香氣；當含量高于4 mg/L時，就可能產生令人生厭的餿飯味（Sour rice），葡萄酒表現變質跡象[39]。由于雙乙酰穩定性較差，能被還原為乙偶姻和2,3-丁二醇，兩者在葡萄酒中的感官閾值很高，分別為150 mg/L和600 mg/L，因此對葡萄酒的風味影響不大[40]。

影響葡萄酒蘋-乳發酵過程中雙乙酰生成的因素較多，如接種的乳酸菌菌株、氧含量、發酵溫度和發酵時間等。要想獲得雙乙酰含量較低的葡萄酒，在酒精發酵后期，接種低產雙乙酰的乳酸菌株系，密切關注蘋-乳發酵進度，當發酵接收后，立即分離滿灌，調整游離SO2到30～45 mg/L[41]。

4.2 老鸛草物質

山梨酸（2,4-己二烯酸）可作為化學防腐劑用于甜葡萄酒的裝瓶，與SO2協同使用防止葡萄酒在酵母存在時進行再發酵。但是，它對細菌沒有作用。而且，它可以被乳酸菌所分解，產生一種很不愉快的氣味讓人想起壓碎的老鸛草葉子（Geranium leaf）。葡萄酒中有乳酸菌時似乎都能引起這種反應。因此，添加山梨酸的葡萄酒裝瓶時要加倍小心，以確保菌群已被消除[11]。

山梨酸被乳酸菌分解首先產生的是2,4-己二烯-1-醇（2,4-hexadiene-1-ol），其乙醛形式很可能是中間產物，但沒有被證實。添加這種醇，與乳酸或者乙酸混合到葡萄酒中產生典型的不愉快氣味。而且，感官閾值下降到初始值的1/50，甚至1/100?，F在已經知道乙醇引起山梨酸分解產物化學結構的調整。首先，在酸性介質中這些分子的重排引起雙鍵的移動和醇的作用，產生3,5-己二烯-2-醇。醚的氧化物在乙醇存在時產生，導致2-甲氧基-3,5-己二烯的生成。這種極其有味的分子也許與其他分子一起在老鸛草氣味中起著重要作用。

5 橡木桶或木塞受真菌污染的不良氣味物質

葡萄酒中軟木塞味是葡萄酒生產中一種重要的異味物質，通常感官描述為濕抹布味、濕霉味、泥土味等不良氣味，這主要是由于酒中含有2,4,6-三氯苯甲醚、2,3,4,6-四氯苯甲醚、五氯苯甲醚等被稱作氯代茴香醚類化合物，這些化合物是橡木桶或軟木塞中的甲基化氯酚物質受真菌（青霉、木霉等）感染生成的。這些氯酚化合物，一方面來源于橡木生長期間的農藥和木材防腐劑，另一方面是消毒期間使用氯基制劑使其中的酚類物質氯化[42]。在過去，酒廠常用氯水來進行木桶消毒或用含氯的自來水進行木桶清洗，這就為TCA（2,4,6-三氯苯甲醚）的產生提供了條件。如今酒廠已經意識到這一點，如改用除氯軟化水清洗橡木桶等，但是只要酒窖曾經產生過TCA污染就很難完全去除。

TCA是葡萄酒中軟木塞味的主要來源，它在葡萄酒中感官閾值只有3 ng/L，痕量的TCA就可以對葡萄酒的風味和品質造成不可逆的破壞，導致大部分的消費者排斥[12]。據估計，全球2%～5%的瓶裝酒因瓶塞受到TCA污染，每年造成的損失估計為十多億美元[43]。此外，TCA的一些降解產物如2,6-二氯苯甲醚和溴化產物如2,4,6-三溴苯甲醚也具有軟木塞異味。

除TCA外，2,3,4,6-四氯苯甲醚、五氯苯甲醚兩種氯代茴香醚類化合物也可在軟木塞味葡萄酒中檢測出來，特別是前者具有霉味，在酒中的嗅覺閾值達到10 ng/L，同樣對酒的品質影響較大。

另外，現有研究表明，一些氯酚如2,4,6-三氯酚、2,3,4,6-四氯酚以及五氯酚等在葡萄酒的釀造過程中由于微生物（青霉、木霉等）的作用也可以轉化為氯代茴香醚類化合物，從而影響葡萄酒品質。因此，在檢測葡萄酒中木塞污染物時，除了檢測直接對葡萄酒風味產生影響的氯代茴香醚類物質，也應該檢測可以轉化為木塞污染物的氯酚類物質[14]。

如葡萄酒在貯存過程中產生TCA污染，添加高吸附性的酵母菌皮可以減少酒中的TCA含量和其他霉味，也可以讓酒通過活性炭過濾系統以除去TCA和相關成分等，但這些操作處理均會造成葡萄酒感官品質明顯下降。因此，在葡萄酒釀造過程中還需以預防TCA污染為主，一是保持酒窖車間清潔和控制濕度，確保充足的通風和冷涼的氣溫以限制霉菌污染；二是減少氯污染源，改善空氣循環，避免使用含氯消毒劑，采用軟化水或純水清洗與酒接觸容器和設備、溶解輔料及加工助劑等；三是嚴格控制封口用軟木塞中TCA含量在1 ng/L以下，將軟木塞濕度控制在8%以下，向貯存袋中添加二氧化硫以控制微生物等。

6 葡萄酒受醋酸菌污染的不良氣味物質

醋酸菌的污染可能發生在葡萄酒釀造過程的各環節，是酒廠最常見的微生物污染。當葡萄原料衛生指標差、酒廠設備和環境衛生狀況不好、葡萄酒貯存時游離二氧化硫濃度不足或橡木桶陳釀管理不到位時，很容易引起醋酸菌污染，進而產生大量的乙酸和乙酸乙酯，使葡萄酒具有膠水（Glue）、食醋的味道[11]。因此，揮發酸指標常稱為葡萄酒健康狀況的“體溫表”，是葡萄酒發酵、貯藏管理不良留下的痕跡。

醋酸、乙醛和乙酸乙酯是葡萄酒中醋酸菌代謝產生的主要腐敗物質。乙酸和乙醛是由乙醇的氧化代謝形成的[44]。此外，醋酸菌還可以形成乙酸乙酯，它具有刺激性的溶劑狀香氣，讓人想起指甲油去除劑[45]。葡萄酒在長時間的木桶陳釀過程中，如果桶不滿或不進行定期監測，很有可能被醋酸菌感染變質，但在葡萄酒的裝瓶和儲存過程中，管理不善會因為巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）的繁殖而導致變質[46]。在正常葡萄酒發酵過程中，由于酵母代謝或在蘋-乳發酵完成后，可檢測到葡萄酒中乙酸的少量增加，通常不超過0.6 g/L。

被醋酸菌污染的葡萄酒很難補救，只能是將其轉變成醋。醋酸菌污染初期發現及時，如酒中乙酸的含量不超過0.8 g/L，可采取過濾澄清、添加SO2、加熱殺菌（75～80 ℃）等方式進行處理。也可用反滲透和離子交換去除乙酸，但是無法去除乙酸乙酯[47]。所以，最好的控制方法依然是預防，避免醋酸菌的污染。首先做好酒廠衛生管理，然后加強葡萄酒貯存管理，如滿罐貯存、保持合理SO2濃度、適度倒罐澄清、罐頂液面充氮氣、定期檢查液面并監測揮發酸指標的變化等。

6 結論

隨著我國葡萄原料質量的提高和葡萄酒釀造技術的改進，葡萄酒中存在的感官缺陷逐步減少。同時，消費者對葡萄酒的質量要求也越來越苛刻，因此更多的研究已經聚焦到影響葡萄酒感官完美的極小瑕疵上[48]。但處理這些極小的缺陷時會降低葡萄酒中存在的自然水果香氣的細膩性，使葡萄酒失去了某些重要特性。

邁入21世紀以來，中國葡萄酒的消費量呈現快速增長的趨勢，并成為同期食品飲料行業中成長速度最快的產業。特別是改革開放40年來，我國葡萄酒產業有了長足的發展，已迅速成長為葡萄酒生產（世界前十）和消費（世界前五）的大國，葡萄酒正逐漸走進普通百姓的家庭，成為了一種健康、精致生活方式的象征。但與歐美等葡萄酒發達國家相比，我國葡萄酒整體質量水平仍待提升，無論生產者或消費者對葡萄酒的認知需不斷提高。在葡萄酒生產過程中，部分產區仍存在葡萄園管理落后，原料質量參差不齊，葡萄酒釀造工藝執行不準確，管理不到位，生產環境或設備衛生條件差等現象，極易發生各類微生物的污染情況，形成一些不良氣味物質，使葡萄酒存在各種感官質量缺陷。

通過系統的闡述了葡萄酒中霉菌、細菌等微生物污染形成的不良風味，包括被灰曲霉等污染的葡萄原料，被酒香酵母、乳酸菌、醋酸菌污染的葡萄酒，被曲霉、木霉等污染的橡木桶和軟木塞等，為葡萄酒工業生產提供借鑒，減少或避免葡萄酒中不良風味物質的出現，從而降低葡萄酒工業的成本，滿足國內人們對葡萄酒日益增加的需求，提高我國葡萄酒在國際市場的競爭力。