LC-MS/MS 法測定紅景天膠囊中紅景天苷含量的方法

方慧君，段 燁，張春麗，黃隆基，王 榮 （中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四〇醫院藥劑科，甘肅 蘭州 730050）

在高原地區，紅景天作為一種常見的抗高原缺氧藥，對其研究和開發具有重要意義。國內外對20 多種紅景天進行了化學成分的研究，證明紅景天苷是有特殊生理、藥理功能的有效單體[1]，而紅景天苷和苷元酪醇是迄今為止，研究最多的有效成分，且由于紅景天中紅景天苷的含量較高，常被用來評價紅景天屬植物藥用價值的指標成分[2-6]。紅景天臨床應用廣泛，對冠心病、高血壓、心肌損傷、急性腦梗死等心腦血管系統疾病都有著良好的治療作用。臨床研究和現代藥理學研究表明，大株紅景天的主要化學成分為絡醇、苷類等化合物，可通過擴張血管，增加血流量，使得心臟后負荷降低，心絞痛得以治療；可使得抗缺氧耐受能力增強，耗氧量降低。紅景天能夠改善心肌細胞中的缺氧誘導因子-1（信使核糖核酸）的表達，從而改善因高原空氣稀薄而引起的缺氧癥狀[7-9]。

目前測定紅景天苷常用高效液相色譜法[10-13]，但靈敏度較低，分析時間較長，為克服這一缺點，筆者采用LC-MS/MS 的分析方法來檢測紅景天膠囊中紅景天苷的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

API3200 三重四極桿串聯質譜儀（美國應用生物系統公司）；LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AE240 電子天平（梅特勒-托利多公司）；高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；渦旋混勻器（金壇市金城教學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

紅景天苷對照品（美國SIGMA-ALDRICH 公司）；茶堿標準品（美國SIGMA-ALDRICH 公司）；紅景天膠囊（西藏軍區紅景天研制中心，批號：190402、190908、180407）。

乙腈（分析純，天津光復化工品研究所）；滅菌注射用水（四川科倫藥業股份有限公司）；甲醇（色譜純，德國MERCK 公司）；乙酸銨（色譜純，天津市北聯精細化學品開發有限公司）。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱為Shim-pack XR-ODS 柱（3.0 mm×75 mm，2.0 μm）；流動相為乙腈-5 mmol/L 乙酸銨溶液（90∶10，V/V）；流速：0.40 ml/min；柱溫：25 ℃；樣品采集量：10 μl；分析時間為3 min。

2.1.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），負離子模式，離子源參數：霧化溫度（TEM）：250 ℃；噴霧電壓（IS）：?3 700 V。多反應監測模式（MRM）參數：紅景天苷和茶堿定量離子對分別為m/z 299.0→119.0，m/z 178.8→164.0，碰撞誘導解離電壓（DP）均為?55 eV；碰撞能量（CE）均為?14 eV。質譜圖見圖1。

圖1 紅景天苷與內標質譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液

精密稱取紅景天苷對照品0.1 mg，置于5 ml容量瓶中，加入5 ml 滅菌注射用水至刻度，搖勻，得濃度20 μg/ml 紅景天苷對照品儲備液，4 ℃冰箱儲存備用。

2.2.2 內標溶液

精密稱取茶堿對照品0.1 mg，置于5 ml 容量瓶中，加入5 ml 甲醇，搖勻，配成20 μg/ml 茶堿對照品儲備液，4 ℃冰箱中儲存備用。

2.2.3 樣品溶液

取10 粒紅景天膠囊，稱重，稱其重量為4.807 6 g。將其去除膠囊殼后，再次稱重為3.602 2 g。取膠囊內容物20 mg，置于5 ml 的棕色瓶中，加入滅菌用水，搖勻，配制成樣品溶液，將此濃度的樣品作為母液，過濾，放置在4 ℃冰箱中保存用于樣品濃度的測定。

2.2.4 供試品溶液

分別精確吸取各濃度紅景天苷的對照品溶液或樣品溶液，置于5 ml 容量瓶中，加入茶堿對照品溶液，加甲醇稀釋至刻度，混勻后，取100 μl 置于0.5 ml 離心管中，13 000×g 高速離心10 min，離心后各吸取50 μl 進行分析，進樣量為10 μl。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下制備的紅景天對照品溶液，按“2.2.4”項下供試品溶液制備方法，配制成10、50、100、250、500、1 000、2000ng/ml 等6 種不同濃度的對照品溶液，茶堿對照品濃度為50 ng/ml。依次進樣，記錄峰面積。以峰面積求得回歸方程：Y=0.003 17X?0.029 1（r=0.999 1）。結果表明，樣品中紅景天苷在10～2 000 ng/ml 范圍內線性關系良好。以S/N＞10 確定，定量下限（LOQ）10 ng/ml。對照品及供試品的色譜圖如圖2。

2.3.2 精密度試驗

精密量取對照品溶液，按“2.1”項下色譜質譜條件連續進樣6 次，測定峰面積。紅景天苷峰面積RSD 為1.9%。儀器精密度良好，符合要求。

2.3.3 重復性試驗

精密稱取同一批號樣品6 份，按“2.2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜質譜條件，分別進樣，測定紅景天苷的峰面積，RSD 為2.7%（n=6），結果表明本方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗

按“2.1”項下色譜質譜條件，分別精密量取在室溫（10～30 ℃）下放置 0、2.5、5、7.5、10、24 h 的同一份供試品溶液進樣測定，記錄紅景天苷的峰面積，6 次進樣結果表明，供試品溶液在 24 h 內基本穩定，RSD 為2.8%。

圖2 紅景天苷HPLC 圖

2.3.5 加樣回收率試驗

取同一批次（批號：190402）已知含量的紅景天膠囊樣品9 份，分別按相當于樣品溶液中紅景天苷含量的80%（n=3）、100%（n=3）、120%（n=3）加入“2.2.4”項下制備的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定。計算回收率，結果回收率在98.7%～103.2%之間，RSD 為2.96%～4.21%，符合要求。

2.3.6 樣品含量測定

根據建立的紅景天苷含量測定方法，3 批次紅景天膠囊（規格：0.3 g/粒）進行含量測定，結果見表1。

表1 紅景天膠囊中紅景天苷含量（n=3）

3 討論

3.1 流動相中乙酸銨濃度選擇

本實驗考察了流動相中不同摩爾濃度的乙酸銨對紅景天苷檢測的影響。當乙酸銨的濃度由2 mmol/L 增大到5 mmol/L 時，紅景天苷色譜峰變尖銳，且靈敏度升高。綜合考慮到色譜峰的峰形、響應值和分析時間，發現當乙腈∶5 mmol/L 乙酸銨=90∶10（V/V）時色譜圖較好。

3.2 定量方法選擇

本實驗采用內標法，有效地消除了由于操作以及儀器本身的系統誤差，提高了測量結果的精確度，特別是在藥物含量較低的樣品分析中，優勢明顯。

綜上所述，所建立測定紅景天膠囊中紅景天苷含量的測定方法，靈敏度高、分析速度快、操作簡單，為控制紅景天膠囊的質量控制標準提供了方法和依據。