用UPLC-MS/MS 法測定肝功能不全患者血漿中伏立康唑的濃度

劉琳琳，宋洪濤，嚴 佳 （中國人民解放軍聯勤保障部隊第九〇〇醫院藥劑科，福建 福州 350025）

伏立康唑（voriconazole）是第二代三唑類廣譜抗真菌藥，主要用于治療由侵襲性曲霉菌、念珠菌等引起的侵襲性感染[1-2]。伏立康唑血藥濃度受多種因素影響，其中，肝臟和腎臟疾病[3]是導致伏立康唑較大個體化差異的重要因素，伏立康唑的臨床療效及不良反應與藥物濃度有明顯相關性[4]。目前用于伏立康唑的血藥濃度監測的方法主要有：酶聯免疫法、高效液相色譜法[5]，超高效液相色譜-串聯質譜法[6]，其中，酶聯免疫法存在假陽性，高效液相色譜法檢測時間較長。本研究采用的超高效液相色譜-串聯質譜檢測方法靈敏度高，簡便快速，適用于伏立康唑血藥濃度監測。由于伏立康唑大部分在肝臟代謝，肝臟疾病患者的血藥濃度具有可變性和不可預知性，尤其是肝功能不全的患者，治療藥物監測對其尤為重要。然而，國內針對肝功能不全患者的伏立康唑藥物濃度監測鮮有報道，筆者應用自建方法對肝功能不全患者進行伏立康唑治療藥物血藥濃度監測，根據患者臨床癥狀和生化指標及時調整用藥方案，避免了藥物不良反應的發生，具有一定的臨床意義。

1 材料

LC-30AT 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB Qtrap 5500 型質譜儀，配有電噴霧電離源 (美國AB SCIEX 公司)。AL 204 型分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；Simplicity 純水儀(美國Millipore 公司)；H1850R 低溫高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；XH-B 型旋渦混合器（湖北姜堰市康健醫療器具有限公司）。伏立康唑對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100862-201402，純度99.8%)；氟康唑對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100314-201605，純度99.8%)；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustain C18HP（3.0 mm×100 mm，3 μm）；流動相：水 -乙腈（15∶85）；流速: 0.3 ml/min，柱溫：35 ℃；進樣量：1 μl。

2.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子多反應監測（MRM）模式監測。噴霧電壓（IS）5 550 V；離子化溫度（TEM）550 ℃；霧化氣（GS1）55 psi；輔助氣（GS2）60 psi；氣簾氣（CUR）)20 psi；碰撞氣（CAD）10 psi；去簇電壓（DP）80 V。伏立康唑和內標氟康唑的定量分析離子分別為m/z：350.9/282.2 和m/z：307.0/238.0；碰撞能量分別為25 V 和22 V。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對照品溶液

精密稱取伏立康唑適量，置10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得1 mg/ml 伏立康唑儲備液，置2～8 ℃冰箱保存，備用。

2.3.2 內標溶液

精密稱取氟康唑適量，置于10 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得1 mg/ml 的氟康唑儲備液，置2～8 ℃冰箱保存，備用。臨用前用甲醇稀釋成500 ng/ml 的內標溶液。

2.4 樣品處理方法

取樣本血漿50 μl，加入500 ng/ml 內標液50 μl，加入甲醇250 μl，在微型混合器上渦流振蕩1 min混勻，13 000 r/min 低溫4 ℃離心5 min，取上清液1 μl 進樣分析。

2.5 專屬性考察

分別取人空白血漿、人空白血漿加伏立康唑對照品和內標溶液、臨床使用伏立康唑的患者血漿樣品加內標溶液，按照“2.4”項下方法處理，按“2.1”和“2.2”項下條件進行檢測。伏立康唑和內標的保留時間分別為4.61、3.64 min，峰形良好，血漿中其他成分對伏立康唑和內標的測定無干擾，方法的專屬性好。結果見圖1。

2.6 線性關系考察

取不同來源的健康人血漿，精密加入不同濃度的對照品溶液，配制成濃度為0.1、0.5、1、2、5、10、20 μg/ml 的標準曲線工作液。以伏立康唑濃度為橫坐標，伏立康唑峰與內標峰面積的比值為縱坐標，采用最小二乘法進行加權回歸計算，回歸方程為：Y=0.732 36 X?0.013 55（r=0.999 5）。結果表明，人空白血漿中伏立康唑在0.1～20 μg/ml 內線性關系良好。本方法伏立康唑定量下限（S/N＞10）為0.1 μg/ml。

2.7 精密度試驗

以人空白血漿為基質，制備濃度分別為0.3、8、15 μg/ml 的低、中、高3 個水平的質控樣品各6份，連續檢測3 d，按“2.4”項下方法處理后分析測定，計算其日內、日間精密度，結果見表1。

2.8 提取回收率和基質效應

取6 個不同來源的健康人空白血漿作為基質，制備濃度分別為0.3、8、15 μg/ml 的低、中、高3 個水平的質控樣品，按“2.4”項下方法處理并測定，得到伏立康唑峰面積A1；以6 個不同來源的人空白血漿甲醇沉淀提取液配制濃度分別為0.3、8、15 μg/ml 的低、中、高3 個水平的樣品各6 份，得到伏立康唑峰面積A2；以流動相代替空白血漿，同樣方法配制備0.3、8、15 μg/ml 的低、中、高3 個水平的樣品各6 份，得到伏立康唑峰面積A3；以A1/A2的值計算提取回收率，A2/A3的值計算基質效應，結果見表1。

2.9 穩定性試驗

以人空白血漿為基質，制備濃度分別為0.3、8、15 μg/ml 的質控樣品，考察樣品室溫放置穩定性（12 h）、凍融穩定性（反復凍融3 次）、冷凍穩定性（?20 ℃放置30 d），結果見表2。

2.10 臨床樣本測定

圖1 伏立康唑和內標提取離子色譜圖

表1 方法學考察結果(n=6)

表2 穩定性考察結果(n=6)

對本院10 名真菌感染使用伏立康唑的肝功能不全患者進行治療藥物監測，穩態谷濃度最大值為18.7 μg/ml，最小值為0.97 μg/ml。在 Pascual 等[7]的研究中，設定伏立康唑的治療藥物濃度范圍為1.0～5.5 μg/ml。其中一名患者肝硬化、膽石癥伴梗阻性黃疸，行經內鏡逆行性胰膽管造影術（ERCP）后膽紅素、C-反應蛋白（CRP）、降鈣素原（PCT）進行性升高，存在膽管感染，且患者反復腹瀉，合并腸道真菌感染，予加用伏立康唑抗真菌治療。用藥前肌酐值81 μmol/L，堿性磷酸酶259 U/L，谷氨酰轉肽酶69 U/L，谷草轉氨酶116.3 U/L，伏立康唑膠囊口服給藥，負荷劑量400 mg，q12 h，維持劑量為200 mg，q12 h，達到穩態谷濃度后監測濃度值為18.7 μg/ml，復查生化，肌酐值151 μmol/L，堿性磷酸酶324 U/L，谷氨酰轉肽酶154 U/L，谷草轉氨酶154 U/L，膽紅素仍持續性升高，伴腎功能不全，為防止發生嚴重肝損害和不良反應，予停藥處理。還有一名患者肝炎后肝硬化、肝功能衰竭伴黃疸，糞便培養出黑霉菌，予伏立康唑抗真菌治療，用藥前肌酐值49 μmol/L，堿性磷酸酶198 U/L，谷氨酸轉氨酶99 U/L，谷草轉氨酶211 U/L。伏立康唑片劑口服給藥，負荷劑量400 mg，q12 h，維持劑量為200 mg，q12 h，達到穩態谷濃度后監測濃度值為10.7 μg/ml，已超出伏立康唑治療窗濃度高限，患者訴視物變黃，初步考慮為藥物引起的不良反應，臨床醫生調整劑量為 100 mg，q12 h，達到穩態濃度后復測伏立康唑的血藥濃度為5.1 μg/ml，視物變黃較前緩解，無視物模糊，黃疸下降，凝血酶原活動度（PTA）改善，感染癥狀有所好轉。

3 討論

在色譜法測定伏立康唑血藥濃度的文獻中，前人多采用乙酸乙酯-環己烷或者三氯甲烷萃取劑提取[8-9]，前處理的過程操作比較復雜，時間長。本研究使用甲醇蛋白沉淀方法，能夠較好地去除血漿樣本中內源性物質的干擾，降低基質效應對檢測的影響，前處理方法簡單快速，縮短了檢測時間。所選內標氟康唑穩定性好，保留時間適宜且峰形好，定量準確，同時，液相方法使用乙腈-水等度洗脫，將分析時間縮短至6 min 以內，分析效率顯著提高。綜上所述，本研究建立的伏立康唑血藥濃度的測定方法具有較好的專屬性，操作簡便，回收率好、靈敏度高，可滿足伏立康唑日常血藥濃度的測定和藥動學研究的需要，為合理使用伏立康唑提供依據。

伏立康唑谷濃度低于治療窗最低濃度時臨床治療效果不好，當谷濃度高于治療窗最大濃度時，中樞系統[10]和肝功能[11]的不良反應發生率會明顯升高。其中，視覺障礙最為常見，與用藥劑量較大或血藥濃度較高有關，一般用藥劑量減少或停藥后可完全恢復?；颊邆€體化差異和藥物間相互作用等因素會導致血藥濃度偏高或偏低，影響伏立康唑的治療效果。此外，患者肝功能不全會影響伏立康唑的代謝，導致代謝時間減慢，半衰期延長，藥物不良反應的發生率增加，從而使得肝損害進一步加重。

本例中兩名患者肝功能損害較嚴重，伏立康唑用藥需更加謹慎。伏立康唑在腦脊液和腦組織液中可達到較高濃度，有研究表明伏立康唑藥物濃度與視覺副作用的發生率呈正相關，臨床藥師通過監測伏立康唑血藥濃度，及時調整用藥，結合患者實際病情制訂個體化給藥方案，提高治療效果，避免了藥物不良反應的發生，為臨床肝功能不全患者合理用藥提供依據。