慢病毒sh-SIRT1 載體對乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響

李 新，田 蜜，王 程

（1.荊門市第二人民醫院甲乳外科，湖北 荊門 448000；2.荊門市公安局法醫鑒定中心，湖北 荊門 448000）

乳腺癌（breast cancer）是女性最常見的惡性腫瘤，嚴重影響女性身心健康[1-3]。據統計[4，5]，世界乳腺癌發病率呈上升趨勢，我國乳腺癌發病率的增長速度高于世界平均增長速度。近年來隨著分子靶向治療在乳腺癌中的作用越來越受到研究者重視，基因靶向治療已逐漸成為乳腺癌研究熱點[6，7]。沉默信息調節因子1（SIRT1）是Sirtuin 家族的第一個成員，參與腫瘤等多種疾病的發生，影響疾病的發展和耐藥性[8-10]。研究表明[11]，siRNA-SIRT1 干擾宮頸癌細胞SIRT1 的表達，可抑制宮頸癌細胞的遷移能力；另有研究發現[12]，順鉑聯合siRNA-SIRT1 可降低宮頸癌細胞耐藥基因的表達水平，從而提高宮頸癌細胞對順鉑的敏感性。因此，本研究通過構建SIRT1 基因的shRNA 慢性病毒載體，觀察SIRT1 在乳腺癌細胞中的表達變化，探討SIRT1 在乳腺癌中的作用及機制，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2017 年1 月～2019 年12 月荊門市第二人民醫院確診的80 例乳腺癌患者的癌組織及癌旁正常組織。納入標準：符合乳腺癌的診斷標準[13]；排除標準：精神病患者；患有其他腫瘤；有手術、化療、放療或抗生素治療史的患者及不配合治療者。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和轉染 乳腺癌細胞株[MDA-MB-2 31（BNCC337893）、SK-BR-3（BNCC100524）]和人正常乳腺細胞[MCF10A（BNCC100439）]均從Bena 培養庫中購買，在37 ℃5%CO2的細胞培養箱中培養細胞。乳腺癌細胞系的培養基體系為1640 培養基（Hyclone 公司）+10%胎牛血清溶液（Gibco 公司）+1%青霉素/鏈霉素溶液（100X，Solarbio 公司），MCF-10A 細胞系的培養體系為DMEM 培養基（Hyclone公司）+10%胎牛血清溶液（Gibco 公司）+1%青霉素/鏈霉素溶液（100X，Solarbio 公司）。隨后實驗將在細胞培養密度達到80%～90%后進行，轉染前1 d，采用無血清培養基代替完全培養基，轉染時將1×105細胞/孔的細胞接種到6 孔板上。用Lipofectamine 2000 轉染試劑盒（Invitrogen，USA）轉染細胞株，轉染4～6 h 后，換成新鮮培完全培養基。在乳腺癌細胞系中表達sh-SIRT1 后，觀察乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1.2.2 慢性病毒空載體的包裝及病毒滴度的測定 從Gen -Bank 中查找 SIRT1 基因的序列（NM 001033578.2），給人類SIRT1 基因設計一個特殊的sh-RNA 序列，陰性對照（NC）作為對照。利用北京Berry 基因組學構建SIRT1 基因的shRNA 慢性病毒表達載體，并采用克隆PCR 法篩選重組克隆進行比對鑒定。將綠色熒光蛋白（GFP）與慢性病毒包裝質粒共轉染MDA-MB-231 和SK-BR-3 細胞。轉染1 d后，改變培養基，培養2 d 后，收集慢性病毒濃縮液感染的MDA-MB-231 和SK-BR-3 細胞，熒光顯微鏡下觀察GFP 表達，評價病毒感染效率。另采用含10% FBS、100 U/ml 青霉素和100 U/ml 鏈霉素的DMEM 培養基，用常規液體交換法傳代感染SIRT1-shRNA 慢性病毒的SK-BR-3 和MDA-MB-231 細胞。將細胞移植到6 孔板中，每孔2×105個細胞。第2 天，當細胞生長密度達到50%左右時，在細胞培養液（10% FBS、4 μg/ml 多胺）中感染相應滴度的病毒溶液。

1.2.3 定量聚合酶鏈反應（qPCR）采用Trizol 純化組織或細胞的總RNA。用總外顯子RNA 和蛋白質分離試劑盒（貨號4478545，Invitrogen）純化外顯子總RNA。用紫外分光光度計在260～280 nm 處檢測總RNA 的濃度和純度，選擇OD260/OD280＞1.8 進行qPCR 檢測。采用Fast-King 一步反轉錄熒光定量試劑盒（北京天根公司，產品目錄號FP314）和ABIPRISM 7000（美國應用生物系統公司）對總RNA 進行反轉錄、PCR 擴增和熒光定量。SIRT1 和mRNA引物由上海桑根生物科技有限公司設計合成。反應體系嚴格按照試劑盒說明書（50 μl）進行：上下游引物1.25 μl，探針1.0 μl，RNA 模板10 μg，50×ROX 參比染料ROX 5 μl，50 μl 總反應體系中加入無RNase dd H2O。反應過程：50 ℃反轉錄30 min；95 ℃預變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40 個循環。結果用ABI 棱鏡7000儀器進行分析，觀察SIRT1 在乳腺癌組織或細胞系中的基因表達水平。采用類似的方法[14]，用qPCR 的方法檢測乳腺癌組織和癌旁組織中SIRT1 的表達，癌組織中SIRT1 的表達大于癌旁組織的平均值一倍以上視為高表達，其余認為是低表達，內參基因為GAPDH。

1.2.4 免疫印跡 收集細胞裂解液，以1,2000 r/min離心15 min。取上清液，SDS-PAGE 電泳分離蛋白。將蛋白質轉移到NC 膜上，在室溫下放置1 h（用5%脫脂牛奶溶液封閉）。加入SIRT1、α-catenin、PTEN、E -cadherin、N -cadherin、β -catenin、Vimentin 和GAPDH 等抗體，放置在4 ℃下過夜。用PBST 溶液清洗NC 膜3 次，加入相應二抗（HRP 交聯），室溫孵育1 h。最后，用PBST 溶液清洗NC 膜，并用增強化學發光法進行可視化處理。內參蛋白為GAPDH，待測蛋白的相對表達水平=待測條帶的灰度值/GAPDH 條帶的灰度值，觀察SIRT1 蛋白及ECT 相關蛋白在乳腺癌組織或細胞系中的表達水平。

1.2.5 細胞遷移和侵襲 采用胰蛋白酶酶解法制備細胞懸液。將細胞接種于2×104細胞/孔的移行上腔（含200 μl 10%胎牛血清+1% DMEM 培養基），并將DMEM 培養基（含10%胎牛血清，總體積500 μl）加入下腔。細胞培養24 h 后，取上腔液，擦去腔壁細胞。用4%的多聚甲醛固定細胞20 min。0.1%結晶紫染色10 min，PBS 緩沖液洗滌。在200 倍顯微鏡下采集細胞遷移圖像。隨機選取5 個視野計算細胞數，取平均值作為細胞數，實驗重復3 次。在上述步驟上，用8%的基質膠鋪貼用于侵襲實驗，每孔細胞數增加到5×104個，觀察sh-SIRT1 在乳腺癌細胞中的轉移能力。

1.2.6 MTT 法檢測細胞活性 用胰蛋白酶酶解法對細胞進行消化，將細胞離心除去酶液，加入新鮮培養基，吹制細胞懸液。取4 個96 孔板，按每孔5×103孔/100 μl 的規格接種細胞，每組3 孔。每24 h 取一孔板，加入5 mg/ml MTT 溶液10 μl/孔，繼續培養1 h，取出培養基，用酶標儀在570 nm 處測定OD 值。實驗重復3 次，觀察細胞活性-時間曲線，分析sh-SIRT1 在乳腺癌細胞中的增殖能力。

1.3 統計學方法 數據采用SPSS 20.0 統計軟件進行處理。計數資料以（n）表示，采用χ2檢驗；計量資料以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SIRT1 在乳腺癌中的表達情況 SIRT1 在乳腺癌中呈高度表達，癌旁組織中呈低表達；與人乳腺上皮細胞（MCF-10A）相比，乳腺癌細胞系（MDA-MB-231、SK-BR-3）中SIRT1 的基因表達增加，見圖1。

2.2 SIRT1 表達與臨床特征的關系 不同年齡、吸煙行為、酗酒行為間SIRT1 表達比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；不同T 分期、N 分期、M 分期間SIRT1表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

圖1 SIRT1 在乳腺癌中的表達情況

表1 SIRT1 表達與臨床特征的關系[n（%）]

2.3 構建慢病毒載體sh-SIRT1 細胞系 在MDAMB-231 細胞系和SK-BR-3 細胞系中構建了sh-SIRT1 的慢病毒表達體系；qPCR 和Western Blot 檢測發現，構建的兩個細胞系中SIRT1 基因水平和蛋白水平表達均明顯下降，見圖2。

圖2 構建sh-SIRT1 的慢病毒表達細胞系

2.4 sh-SIRT1 對乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響 MTT 法檢測顯示，在MDA-MB-231 細胞和SK-BR-3 細胞中sh-SIRT1 可抑制乳腺癌細胞的增殖（圖3）。Transwell 法檢測顯示，在MDA-MB-231細胞中sh-SIRT1 可抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲（圖4）。

圖3 sh-SIRT1對乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 sh-SIRT1 對MDA-MB-231 細胞遷移和侵襲的影響

2.5 sh-SIRT1 對乳腺癌細胞EMT 過程的影響Western Blot 檢測顯示，sh-SIRT1 可抑制α-catenin、PTEN 和E-cadherin 表達下調（圖5A），促進N-cadherin、β-catenin 和Vimentin 表達上調（圖5B）。

圖5 sh-SIRT1 對乳腺癌細胞EMT 的影響

3 討論

慢性病毒載體是目前最適合體內基因轉化甚至基因治療的載體工具[15，16]。研究表明[17]，慢性病毒載體是在免疫缺陷病毒的基礎上發展起來的一種基因治療載體，屬于自殺病毒。慢性病毒載體能產生表達shRNA 的高滴度病毒，誘導基因表達的穩定功能沉默，成為沉默細胞基因，其介導的RNA 干擾技術對基因治療的發展具有重要意義[18，19]。

本研究結果發現，SIRT1 基因在乳腺癌組織中呈高表達，在乳腺癌細胞系SK-BR-3 和MDA-MB-231 中也呈高表達，表明SIRT1 在乳腺癌中上調。此外，通過對80 例乳腺癌患者臨床特征進行分析，結果發現SIRT1 在T3/T4、N1和M1中高表達，而與年齡、吸煙和酗酒無相關關系，這也提示SIRT1 參與了乳腺癌的轉移進展過程。此外，本研究成功構建了慢病毒載體sh-SIRT1 細胞系，并發現sh-SIRT1 可以抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，這與SIRT1在乳腺癌的發病與轉移中具有高表達相一致。SIRT1 是一個組蛋白脫乙?；讣易?，參與不同細胞中各種蛋白質的乙?；揎梉20]。有研究表明[21]，SIRT1 通過調節谷氨酰胺代謝，抑制細胞生長、增殖和轉化，從而發揮其促癌作用。另有研究表明，SIRT1 通過乙?；毎酥械陌械鞍赘淖兗毎钚圆⒂绊懫浼毎麅裙δ躘22]，惡性腫瘤的侵襲轉移與SIRT1 表達的上調密切相關，SIRT1 下調會抑制肝癌和卵巢癌細胞的生長[23]，與胰腺癌[24]、肝癌[25]和肺癌[26]等均密切相關。Wu SH 等[27]研究表明，shRNA 慢性病毒載體對CCR3 基因表達的抑制作用可以有效地減少肥大細胞在局部組織中的遷移、浸潤和脫顆粒，減輕變應性鼻炎小鼠的炎癥反應。本研究通過建立shRNA 慢病毒載體進一步補充了SIRT1 對乳腺癌細胞的生物學功能。同時，通過shRNA 慢病毒載體干擾SK-BR-3 和MDAMB-231 細胞中SIRT1 的表達，觀察了sh-SIRT1 對乳腺癌細胞EMT 過程的影響，結果表明EMT 相關蛋白α-catenin、PTEN 和E-cadherin 在乳腺癌細胞中出現表達下調，N-cadherin、β-catenin 和Vimentin 出現表達上調，這為SIRT1 參與乳腺癌的發生發展及轉移提供了依據。研究報道[28，29]，SIRT1 的mRNA 和蛋白水平降低，從而抑制EMT 并影響EMT 相關分子，包括PTEN 和E-cadherin。Qi HF 等[30]通過雙熒光素酶報告基因檢測證實了SIRT1 是miR-448 的直接靶點，激活SIRT1 將逆轉miR-448 模擬物誘導的非小細胞肺癌細胞EMT 生長抑制能力，并起到破壞作用。以上結果表明，慢病毒sh-SIRT1 干擾SIRT1 表達，αcatenin、PTEN、E-cadherin 等細胞間聚集的粘附分子表達水平上調，最終抑制乳腺癌細胞EMT 的增殖。慢病毒sh-SIRT1 干擾SIRT1，會抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。然而，本研究中SIRT1 慢病毒載體與乳腺癌細胞增殖的關系只是初步研究，在未來的實驗設計中SIRT1 所涉及的信號通路可以作為SIRT1 致癌網絡的補充。

綜上所述，SIRT1 在乳腺癌細胞中高表達，慢病毒sh-SIRT1 載體可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。因此，SIRT1 基因shRNA 慢病毒載體在乳腺癌靶向治療中具有潛在的應用價值。