下調miR-199a-5p抑制脂多糖誘導的大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞系AECⅡ凋亡

王 偉，趙四林，范伏元，金朝暉，李 妲，符 艷

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院 呼吸內科，湖南 長沙 410007)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pul-monary disease，COPD)簡稱慢阻肺，是一種常見的慢性呼吸系統疾病，COPD的發病機制除了與炎性反應、氧化與抗氧化失衡等有關外，還與細胞凋亡有關[1]。Ⅱ 型肺泡上皮細胞(type Ⅱ alveolar epithelial cells，AEC Ⅱ )是肺泡上皮細胞的干細胞，AEC Ⅱ 的異常凋亡在COPD發病過程中起重要作用，降低AEC Ⅱ 凋亡可能是治療COPD的一種途徑。研究顯示，miR-199a-5p在COPD患者肺組織中表達升高，可能參與COPD的發生發展進程[2]。但miR-199a-5p對型肺泡上皮細胞凋亡的影響還尚不清楚，因此本實驗用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導大鼠 Ⅱ 型肺泡上皮細胞凋亡，研究miR-199a-5p對 Ⅱ 型肺泡上皮細胞凋亡的影響及可能機制，以期為COPD的分子治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床資料:選取2017年4月至2018年12月于湖南中醫藥大學第一附屬醫院就診的45例COPD患者，男性23例，女性22例，年齡47～71歲，平均年齡(60.4±6.8)歲。COPD診斷標準符合2013版《慢性阻塞性肺疾病診斷指南》。排除標準：惡性腫瘤患者；心臟、腎等重要器官功能不全者；急慢性炎性反應疾病患者；自身免疫疾病患者。另選取同時期45名健康體檢者，男性21例，女性24例，年齡45～70歲，平均年齡(60.6±6.9)歲。兩組患者年齡、性別等一般資料無差異。本研究經醫院倫理委員會批準同意(1811017)，患者自愿簽署知情同意書。

1.1.2 細胞和試劑:大鼠Ⅱ型肺泡上皮細胞系(AECⅡ)(上?？吕咨锟萍加邢薰?；DMEM培養基(北京索萊寶科技有限公司)；反轉錄試劑盒和PCR試劑盒(深圳晶美生物工程有限公司)；Trizol試劑(Invitrogen公司)；二喹啉甲酸(bicinchoninicacid，BCA)蛋白檢測試劑盒、膜聯蛋白V(annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細胞凋亡試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)； 卷曲受體4(frizzled receptor 4,FZD4)、B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、B淋巴細胞瘤-2相關蛋白 (Bcl-2-associated X protein，Bax)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體(北京中杉金橋生物試劑公司)；miR-199a-5p模擬物及模擬對照序列(miR-NC)、miR-199a-5p抑制劑(anti-miR-199a-5p)及抑制劑陰性對照序列(anti-miR-NC)、FZD4的小干擾RNA(si-FZD4)及亂序無意義陰性序列(si-NC)(廣州銳博生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞的培養與分組：復蘇AECⅡ細胞，加入含10% FBS的DMEM培養基中培養，待細胞增殖匯合至80%～90%時，進行消化傳代培養。將AECⅡ分為對照組(control)、LPS組(100 ng/mL LPS)、anti-miR-NC組(轉染miR-199a-5p抑制劑陰性對照序列)、anti-miR-199a-5p組(轉染miR-199a-5p抑制劑)、miR-NC組(轉染miR-199a-5p模擬物對照序列)、miR-199a-5p組(轉染miR-199a-5p模擬物)、anti-miR-199a-5p+LPS組(轉染miR-199a-5p抑制劑后用100 ng/mL LPS培養)、anti-miR-NC+LPS組(轉染miR-199a-5p抑制劑陰性對照序列后用100 ng/mL LPS培養)、anti-miR-199a-5p+si-FZD4+LPS組(同時轉染miR-199a-5p抑制劑與FZD4小干擾RNA后用100 ng/mL LPS培養)和anti-miR-199a-5p+si-NC+LPS組(同時轉染miR-199a-5p抑制劑與FZD4亂序無意義陰性序列后用100 ng/mL LPS培養)。

1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-199a-5p和FZD4 mRNA表達：Trizol試劑提取患者血清或細胞中總RNA，定量后按試劑盒說明反轉錄為cDNA。然后按PCR試劑盒說明進行PCR擴增。引物序列miR-199a-5p上游5′-GTCGATACCAGTGCGT GTCGTCGTGTCGGC-3′，下游5′-AATTGCACTGGATA CGACAGCCTAT-3′；FZD4上游5′-CCTCGGCTACAAC GTGACC-3′，下游5′-TGCACATTGGCACATAAACAG A-3′；U6上游5′-CTGGTAGGGTGCTCGCTTCGGCAG-3′，下游5′-CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC-3′；GAPDH上游5′-GCCACATCGCTCAGACACC A-3′，下游5′-CT CAGCCTTGACGGTGCCAT-3′。采用2-△△Ct法計算miR-199a-5p相對于U6、FZD4、GAPDH相對表達水平。

1.2.3 流式細胞計量術檢測細胞凋亡：各組細胞培養24 h后，PBS清洗2次，用結合緩沖液混懸細胞。依次加入10 μL annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min后上流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.4 Western blot檢測細胞中FZD4、Bax和Bcl-2蛋白表達：用RIPA裂解液提取細胞總蛋白，BCA法定量。蛋白樣品變性，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至聚偏乙烯二氟(PVDF)膜，封閉，加入FZD4(1∶500)、Bax(1∶1 000)、Bcl-2(1∶1 000)和GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃孵育過夜；加入辣根過氧化酶標記的二抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h。加入化學發光試劑，成像后用Image J軟件分析目的蛋白條帶吸光度值，以GAPDH為內參。

1.2.5 miR-199a-5p與FZD4靶向關系驗證：1)Target Scan生物信息學軟件預測顯示，FZD4的3′UTR與miR-199a-5p的核苷酸序列存在連續結合位點。構建FZD4野生型和突變型雙熒光素酶報告質粒(FZD4-WT)和(FZD4-MUT)。分別將miR-199a-5p模擬物與FZD4-WT(miR-199a-5p+ FZD4-WT組)、模擬物對照序列與FZD4-WT(miR-NC+FZD4-WT組)、miR-199a-5p模擬物與FZD4-MUT(miR-199a-5p+FZD4-MUT組)、模擬物對照序列與FZD4-MUT(miR-NC+FZD4-MUT組)共轉染至細胞，培養48 h后參照試劑盒說明檢測熒光素酶活性。2)anti-miR-199a-5p組、anti-miR-NC組、miR-199a-5p組和miR-NC組細胞分別接種于24孔板中，培養24 h后，Western blot檢測FZD4蛋白表達水平，方法同1.2.4。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 COPD患者血清中miR-199a-5p和FZD4 mRNA表達水平

與對照比較，COPD患者血清中miR-199a-5p表達水平升高(1.93±0.13vs1.04±0.09)(P<0.05)，而FZD4 mRNA表達水平降低(0.30±0.05vs1.03±0.09)(P<0.05)。

2.2 LPS對AECⅡ細胞中miR-199a-5p和FZD4表達的影響

與對照組比較，LPS組AECⅡ中miR-199a-5p的表達水平升高(P<0.05)，FZD4 的mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.05)(圖1)。

2.3 下調miR-199a-5p對LPS誘導的AECⅡ細胞凋亡及凋亡蛋白表達的影響

與對照組比較，LPS組miR-199a-5p表達水平升高，細胞凋亡率和Bax表達水平顯著升高(P<0.05)，而Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)。與anti-miR-NC+LPS組和LPS組比較，anti-miR-199a-5p+LPS組miR-199a-5p表達水平降低，細胞凋亡率和Bax表達水平顯著降低(P<0.05)，而Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)(圖2)。

A.the effect of LPS on the expression of miR-199a-5p in AEC Ⅱ cells; B.the effect of LPS on the expression of FZD4 mRNA in AEC Ⅱ cells; C.the effect of LPS on the expression of miR-199a-5p and FZD4 protein in AEC Ⅱ; *P<0.05 compared with control group

A.the effect of down-regulating miR-199a-5p on apoptosis rate of LPS-induced AECⅡ cells; B.the effect of down-regulating miR-199a-5p on the expression of apoptosis-related proteins Bcl-2 and Bax in LPS-induced AECⅡ cells; *P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with anti-miR-NC+LPS group；△P<0.05 compared with LPS group

2.4 miR-199a-5p靶向負調控FZD4表達

TargetScan生物信息學軟件預測顯示，FZD4的3′UTR與miR-199a-5p的核苷酸序列存在結合位點。與miR-NC+FZD4-WT組比較，miR-199a-5p+FZD4-WT組熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-199a-5p組FZD4表達顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-NC組比較，anti-miR-199a-5p組FZD4表達顯著升高(P<0.05)(圖3，4)。

A.the binding site of the 3′UTR of FZD4 and the nucleotide sequence of miR-199a-5p; B.the result of dual luciferase activity detection; *P<0.05 compared with miR-NC+FZD4-WT group圖3 miR-199a-5p靶向結合FZD4Fig 3 miR-199a-5p targets binding to FZD4

*P<0.05 compared with anti-miR-NC group; #P<0.05 compared with miR-NC group圖4 miR-199a-5p對AEC Ⅱ細胞中FZD4蛋白表達的影響Fig 4 Effect of miR-199a-5p on the protein expression of FZD4 in AEC Ⅱ cells

2.5 下調FZD4表達降低miR-199a-5p對LPS誘導的AECⅡ細胞凋亡的影響

與anti-miR-199a-5p+si-NC+LPS組比較，anti-miR-199a-5p+si-FZD4+LPS組FZD4蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)，凋亡率和Bax表達水平顯著升高(P<0.05)，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)(圖5)。

3 討論

COPD發生發展過程中，肺泡上皮細胞等肺組織細胞凋亡增加[3]，抑制肺組織細胞凋亡對于COPD的預防和治療具有重要意義。AECⅡ是肺泡上皮細胞的干細胞，參與肺泡更新和損傷修復，調節肺泡液體量和成分。研究表明，miR-199a-5p參與COPD的發生發展過程。如文獻[4]報道稱，miR-199a-5p在急性加重期COPD患者血清中表達水平顯著高于健康人群，其高表達與GOLD分級、mMRC分級相關。此外，COPD患者肺組織中miR-199a-5p表達水平也升高[5]，且還有研究報道miR-199a-5p可能參與COPD患者機體內Treg細胞調節免疫平衡[6]。本實驗結果顯示，COPD患者血清中miR-199a-5p表達水平顯著升高。此外，本研究還顯示，LPS可促進AECⅡ中細胞miR-199a-5p的表達，下調miR-199a-5p表達后，LPS誘導的AEC Ⅱ細胞凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是凋亡相關的重要分子，Bcl-2表達增加可抑制細胞凋亡，而Bax表達增加則促進細胞凋亡。因此，本實驗結果提示下調miR-199a-5p表達可有效抑制LPS誘導的AECⅡ細胞凋亡。

生物信息學軟件預測顯示，FZD4的3′UTR與miR-199a-5p的核苷酸序列存在連續的結合位點，FZD4可能是miR-199a-5p的靶基因。本研究通過雙熒光素酶報告基因實驗證實了miR-199a-5p可靶向調控FZD4。本實驗還發現下調AECⅡ中miR-199a-5p表達后，FZD4蛋白表達升高，而上調miR-199a-5p表達后，FZD4蛋白表達降低，進一步說明miR-199a-5p在AECⅡ中細胞靶向負調控FZD4表達。FZD4是Wnt信號通路上一個7次跨膜受體分子，參與組織損傷修復。研究報道COPD患者肺組織和原代肺泡上皮Ⅱ型細胞中FZD4呈低表達，低表達降低導致肺泡修復能力受損[7]。本實驗結果顯示，COPD患者血清中FZD4 mRNA表達水平顯著降低，與文獻報道一致。且LPS誘導的AECⅡ細胞中FZD4的mRNA和蛋白表達降低，提示FZD4參與COPD的發生發展過程。本研究還顯示，下調FZD4表達可降低下調miR-199a-5p表達對LPS誘導的AECⅡ細胞凋亡的抑制作用，提示下調miR-199a-5p表達通過上調ZD4表達來抑制LPS誘導的AECⅡ細胞凋亡。

A.the effect of down-regulating FZD4 and miR-199a-5p on apoptosis rate of LPS-induced AECⅡ; B.the effect of down-regulating FZD4 and miR-199a-5p on the expression of apoptosis-related proteins FZD4, Bcl-2 and Bax in LPS-induced AECⅡ; *P<0.05 compared with anti-miR-199a-5p+si-NC+LPS group

綜上所述，下調miR-199a-5p表達可有效抑制LPS誘導的AECⅡ細胞凋亡，其作用機制可能與上調FZD4表達有關，miR-199a-5p/FZD4軸可能為COPD的治療提供了新靶點。