淺析牛巨噬細胞內氣腫疽梭菌細胞內存活機制

楊大偉，張光磊

吉林省敦化市農業農村局畜牧站，吉林 敦化 133700

氣腫疽梭菌是黑腿病的病原體，氣腫疽是國內反芻動物易感的一種嚴重性疾病，該病可引發肌肉壞死和毒血癥，并伴隨高死亡率。盡管眾所周知預防該病暴發的重要性，但至今相關對黑腿病發病機制的研究卻少之又少，并且很多研究基于未經證明的假設。其中一種假設認為轉運氣腫疽梭菌孢子從反芻動物的腸道到肌肉，是巨噬細胞起到主要作用的原因。因此，現在的研究目的在于檢測氣腫疽梭菌或者孢子在通過牛單細胞源的巨噬細胞的吞噬作用后是否能夠保持活性，并展示出炎性反應以及由氣腫疽活性細胞或者孢子感染牛巨噬細胞后產生相應的抗炎性細胞因子轉錄子。這些結果更能證實此典型的假設：在黑腿病的早期發病機制中，巨噬細胞可能起到十分重要的作用。

氣腫疽梭菌是一種革蘭氏陽性厭氧菌，可以形成氣性壞疽，抑或在人和其它物種產生惡性水腫。氣性壞疽通常發生在創傷污染物，一般是在接種疫苗、分娩、剪毛或者抽血期間，與此同時伴隨著一種或多種梭狀菌的感染從而導致該病，相比于惡性水腫，在沒有任何創傷存在之前，氣腫疽通常被認定為非創傷性或內源性疾病，但值得確認的是環境中的氣腫疽梭菌的孢子在吞噬作用下隨后通過巨噬細胞從腸道轉移至肌肉，從而保持一種潛伏狀態。一個小創口或者任何其他條件都會讓這些組織中的氧氣攝入量減少，進而導致氣腫疽梭菌的激增，隨后發展成為肌肉壞死甚至病畜死亡。盡管都知道預防氣腫疽在牛的飼養中極其重要，但是直到現在仍然沒有數據可以說明氣腫疽梭菌和吞噬細胞之間的關系，事實上在先天免疫中關于巨噬細胞的抵御作用僅限于A型產氣型莢膜梭菌，在巨噬細胞的內化后，氣腫疽梭菌的細胞和孢子仍然保持活力，這種細菌可以引發動物的氣性壞疽發生，進而再傳染給人。因此該研究旨在檢測氣腫疽活細胞或者孢子通過牛單核細胞衍生的巨噬細胞的吞噬作用后的存活性，同時分析比較在此感染后的牛巨噬細胞的炎性以及抗炎性細胞因子轉錄子的屬性。此外，該研究亦能證實梭菌屬菌種感染牛單核細胞衍生的巨噬細胞的感染動力學和細胞因子屬性。

1 材料與方法

1.1 準備菌株和牛巨噬細胞系

從病畜體內獲取已經感染的細胞，進行氣腫疽梭菌的菌株培養；并同時從健康的牛體內提取巨噬細胞進行細胞培養，每隔24 h換液。

1.2 感染巨噬細胞

將已經培養好的菌株感染牛正常的巨噬細胞系，然后繼續培養24 h，每12 h換液。

1.3 形態學觀察

將培養好的感染氣腫疽菌株的牛巨噬細胞在電子顯微鏡下進行鏡下觀察，并記錄其形態學特點。

1.4 單核細胞衍生的巨噬細胞分離、培養和感染

將單核衍生的巨噬細胞用離心機3 000轉/s，4 ℃進行離心分離，棄上清液，再次清洗，轉移至細胞培養液在二氧化碳細胞培養箱37 ℃培養，之后進行轉染。

1.5 檢測受感染牛單核細胞衍生的巨噬細胞后細胞因子屬性

用檢測細胞因子的專屬ELISA試劑盒，檢測感染后的巨噬細胞的炎性因子和抗炎性因子。

2 結果

2.1 測定感染牛巨噬細胞后的氣腫疽梭菌的存活性

氣腫疽梭菌的生長細胞和孢子通過牛巨噬細胞的吞噬作用后都保持存活狀態。然而在繁殖體中的氣腫疽梭菌在牛巨噬細胞中表現為逐漸地減少。在感染24 h后，細胞外存活梭菌被完全清除，然而盡管用大量的洗滌液，也不可能將所有的細胞外梭菌孢子清除干凈，但是在受感染24 h以后，細胞外梭菌孢子數量顯著減少相比較內化的梭菌孢子。超微結構分析感染動力學顯示自始至終，細菌的形成（包括活性細胞以及孢子）是在吞噬小囊泡進行內化作用，細胞內孢子的完整性表明整個吞噬過程沒有起到損傷菌體的作用。

2.2 氣腫疽梭菌感染牛巨噬細胞后細胞因子轉錄子表現屬性

在感染的12 h以后，被氣腫疽梭菌活性細胞內化后的牛巨噬細胞誘導炎性細胞因子轉錄，與之相反的是，在感染的24 h以后，內化后的氣腫疽梭菌孢子誘導大量的抗炎性細胞因子轉錄。

3 討論

氣腫疽梭菌感染在反芻動物里是一種常見的疾病。在牛中，黑腿病在臨床上是一種眾所周知的嚴重性疾病，但是它的發病機制至今還未被完全理解透徹，已經存在假設氣腫疽梭菌孢子是通過巨噬細胞從腸道或口腔創傷轉運到肌肉當中，一旦進入到這些組織中氣腫疽梭菌孢子會保持休眠狀態直到引發缺氧狀態，在缺氧的條件下最終在初始期、激增期產生外毒素，這也是臨床病變發生的原因。在現代的研究中，氣腫疽梭菌的動力學在鼠科動物的巨噬細胞中研究的最多，在確認氣腫疽梭菌能在傳代細胞系存活后，開始對這種細菌在牛的單核細胞衍生的巨噬細胞中的動力學進行驗證，并且在用氣腫疽梭菌活性細胞或者孢子感染牛巨噬細胞后的細胞因子的炎性以及抗炎性轉錄子進行分析，同時將牛巨噬細胞中氣腫疽梭菌的活化物與鼠科動物巨噬細胞中菌體活化物進行比較，對比二者抗炎性細胞因子轉路子，可以間接判斷其細胞因子轉路子的屬性，從而能夠證明這個典型的假設在黑腿病早期的發病機制中，巨噬細胞可能起到很重要的作用。傳統上致病的梭菌屬是細胞外微生物的轉錄子轉錄而成，產生強有力的毒素致使感染的宿主造成一系列的嚴重損傷。然而在過去的幾年里，研究表明在鼠科動物里，產氣莢膜梭菌在巨噬細胞內化后仍然能夠持續存活，我們的研究顯示氣腫疽梭菌在巨噬細胞吞噬作用后也能夠保持抵抗細菌消除機制。之前的研究證明在鼠科動物中，在巨噬細胞的氣腫疽梭菌的孢子在受到感染的72 h后仍能存活，這種結果可能是由于孢子在潛伏期的休眠性所導致的。