長鏈非編碼RNA THOR在食管鱗狀細胞癌中的表達及作用機制研究

蒲文杰，鐘曉武,，徐磊，高川力，李青容，程吉兵，周錫，楊密淵，郭曉蘭,

(川北醫學院，1.附屬醫院檢驗科；2檢驗系；3.轉化醫學研究中心，四川 南充 637000)

食管癌(esophageal carcinoma，EC)是全球第8大惡性腫瘤，也是第6大腫瘤死亡原因[1]。2018年全世界新增確診食管癌患者約572 034人，死于約508 585人，其中近一半發生在中國，且主要以食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)的病理類型出現，其相關死亡率位居惡性腫瘤致死的第四位，是造成人類死亡的主要原因之一[2-4]。近年來，雖然外科手術、放療、化療、免疫治療等治療方法不斷改進，但由于EC發病隱匿且缺乏有效用于EC早期診斷的分子生物標記物，導致EC早期診斷困難，約50%的EC患者在疾病后期或晚期接受診斷時已出現轉移[5]。

長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，是基因組轉錄產物中不具有編碼蛋白質的基因序列，廣泛存在于所有真核生物的細胞核與細胞質中，且在不同組織中表達具有特異性[6]。已有研究表明LncRNA可通過多種形式參與轉錄調控，如染色質修飾、染色體沉默、基因組印記等多種生物學功能，進而參與調節細胞增殖和凋亡、細胞周期、細胞代謝等生命活動過程[7-10]。LncRNA的多功能的生物學特征，決定了其異常表達將與各類疾病特別是惡性腫瘤密切相關。睪丸相關的高保守的致癌長非編碼RNA (testis-associated highly-conserved oncogenic long non-coding RNA，LncRNA THOR)屬于基因間型的LncRNA，具有序列保守的特性且主要表達于正常睪丸和腫瘤組織中。研究發現LncRNA THOR能夠促進腎癌細胞和骨肉瘤細胞在體內外的增殖生長。還能通過提高鼻咽癌細胞干性，降低鼻咽癌細胞對順鉑的敏感性[11-13]。LncRNA THOR還可以直接與胰島素樣生長因子2 mRNA 結合蛋白1 (insulin-like growth factor 2 mRNA binding protein 1，IGF2BP1)結合，并調控胰島素樣生長因子2 (insulin-like growth factor 2，IGF2)、膠質瘤相關癌基因同系物1(gliom-associated oncogene homolog 1，GLI-1)與MYC等下游靶基因，最終影響腫瘤發生的進展。然而，LncRNA THOR在ESCC中表達情況及其可能的作用機制尚未有報道。本研究旨在分析ESCC中LncRNA THOR的表達情況，并且進一步探討其在ESCC中的潛在功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織 收集川北醫學院附屬醫院胸外科食管癌病例20例，所有病例均由經驗豐富的病理醫師確診，組織標本經手術離體30 min內剪取適量腫瘤中心組織，同時剪取距離切緣5 cm的癌旁正常食管上皮組織，立即浸在裝有RNAlater solution 的EP管中放入冰盒中運輸，置于-80 ℃保存。該項研究符合《赫爾辛基宣言》，在獲得倫理審查委員會批準及每一位患者知情同意的前提下進行組織標本及患者信息的收集。

1.1.2 細胞株 人食管鱗狀細胞癌細胞系TE1、EC109、KYSE150以及正常食管鱗狀上皮細HET-1A由川北醫學院轉化醫學研究中心提供。

1.2 方法

1.2.1 UALCAN分析 UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/index.html)是一個基于癌癥基因組圖譜(TCGA)數據庫，具備在線分析目的基因表達、相關性、預后分析和挖掘等功能的網站。首先登陸UALCAN，點擊TCGA analysis，輸入Gene names為LncRNA THOR，在TCGA dataset選擇Esophageal carcinoma，然后點擊Expression，分析LncRNA THOR在TCGA數據庫中食管癌不同亞組中的表達情況。

1.2.2 RNA提取 提取細胞/組織總RNA 時，先預冷PBS清洗2～3遍，加入1 mL Trizol裂解細胞15 min，待貼壁細胞完全脫落后，移至2 mL EP管。使用美國Thermo Fisher公司核酸濃度檢測儀檢測RNA濃度和吸光度(A值)，再應用德國Roche公司Transcriptor FirstStrand cDNA Synthesis試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA。

1.2.3 qRT-PCR 首先通過生工生物工程(上海)股份有限公司合成目的基因LncRNA THOR、GLI-1、MYC和內參基因GAPDH的基因引物序列，見表1。再利用qRT-PCR將獲取的組織、細胞cDNA分別進行mRNA檢測。擴增反應總體積為20 μL，包括Fast SYBR Green Master mix 10 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板1 μL，加入滅菌滅酶ddH2O至總體積20 μL，每個樣本上3個復孔。qRT-PCR反應結果數據采用德國Roche公司Light Cycler 96系統分析，按照公式2-ΔΔCT計算組織和細胞中目的基因的mRNA相對表達量。

表1 LncRNA THOR、GLI-1、MYC和內參基因GAPDH的基因引物序列

1.2.4 siRNA實驗 兩條不同LncRNA THOR siRNA序列，5′-CUACAUGGGUAAUCAAUAU-3′(si-LncRNA THOR-1)，5′-CUAUGGUGUGUGAACAUUA-3′(si-LncRNA THOR-2)及其對照序列購于生工生物工程(上海)股份有限公司，Viafect轉染試劑購于Promega公司。將處于對數期增殖的食管癌細胞按3×106個/孔均勻平鋪在六孔板，細胞生長密度達到50%時，開始進行轉染。更換為不含胎牛血清和雙抗的DMEM培養基，把si-NC(對照)、si-LncRNA THOR-1、si-LncRNA THOR-2和Viafect轉染試劑，加入食管鱗狀細胞癌細胞系TE1中，在37 ℃、5% CO2的培養箱培養48 h后檢測轉染效率。

1.2.5 CCK-8實驗 取對數生長期食管癌TE1細胞，經胰蛋白酶-EDTA消化液消化后制成單細胞懸液，計數細胞，調整濃度為5×104/mL，96孔板每孔接種100 μL細胞懸液，設置4個平行組，每組設3個復孔和一個空白孔(只加100 μL培養基)，待細胞貼壁后，繼續培養0 h、12 h、24 h、48 h。每個時間點取出一組細胞，每孔加入10 μL CCK8試劑，細胞培養箱內孵育1 h后放入酶標儀于450 nm波長處測定吸光度值(A)，以時間(h)為橫坐標，A為縱坐標繪制生長曲線，實驗重復3次。

1.2.6 劃痕試驗 轉染細胞傳代至6孔板內，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基培養，待細胞單層融合度達90%左右時用10 μL槍頭垂直桌面在六孔板孔內劃井字，完成后用PBS洗去孔內的懸浮細胞，選取劃痕整齊的部位拍照，并標記拍照點，用含10%胎牛血清的DMEM完全培養基繼續培養，劃痕12 h、24 h、48 h后，觀察選取位置劃痕寬度變化并拍照保存。

1.2.7 Western blot 使用RIPA試劑裂解轉染成功后的腫瘤細胞，冰上孵育至完全裂解，4 ℃、12 000 rpm，離心30 min，采用BCA法蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo Fisher公司)檢測蛋白濃度。配置10%凝膠，按照總蛋白40 μg，總體積10 μL上樣，恒壓80 V電泳至濃縮膠和分離膠交界處時，調整電壓至120 V繼續電泳至樣本遷移至凝膠末端處。在250 mA恒流下轉膜90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉60 min，PBST洗PVDF膜3次，5 min/次，按說明書稀釋一抗GLI-1(兔源，貨號：ET1702-85)、MYC(鼠源，貨號：EM1902-38)，抗體購自杭州華安生物技術有限公司。將PVDF膜平整放置于孵育盒中，4 ℃振揺過夜。PBST洗PVDF膜3次，5 min/次，孵育對應的兔源/鼠源二抗(杭州華安生物技術有限公司)60 min后避光顯影。

1.3 數據分析

2 結果

2.1 LncRNA THOR與EC患者臨床數據的相關性分析

利用UALCAN數據庫在線分析LncRNA THOR的表達情況，分別從EC的LncRNA THOR在不同樣本類型、腫瘤分期、腫瘤分級、性別、年齡、體重、種族、吸煙、腫瘤亞型等幾個方面進行統計分析，結果如圖1所示：LncRNA THOR在EC患者的表達顯著高于正常人，腫瘤分期為II和 III期，腫瘤分級為II和III級，年齡段為40～80歲，種族為高加索人和亞洲人的食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EAC)和ESCC男性患者也顯著高表達。

2.2 LncRNA THOR在ESCC癌組織和細胞的表達都升高

通過qRT-PCR檢測20例ESCC癌組織和癌旁組織的LncRNA THOR 表達，發現ESCC癌組織中LncRNA THOR 表達水平對比癌旁組織顯著升高(P<0.05)(圖2)。實驗結果與TCGA的數據一致都印證LncRNA THOR在ESCC中高表達，暗示LncRNA THOR可能是ESCC的促癌基因。

通過qRT-PCR檢測ESCC細胞系TE1、 EC109和 KYSE150和正常食管上皮細胞HET-1A中 LncRNA THOR 的表達情況，結果顯示TE1和EC109中LncRNA THOR 表達水平對比HET-1A明顯上調(P<0.05)(圖3)。

2.3 siRNA-LncRNA THOR敲降TE1細胞中LncRNA THOR的表達水平

將化學合成2個靶點siRNA (siRNA-LncRNA THOR-1和siRNA-LncRNA THOR-2) 轉染TE1細胞后，LncRNA THOR的表達量均降低(P<0.01) (圖4)。結果表明，本實驗成功構建LncRNA THOR敲降的TE1細胞。

2.4 敲降LncRNA THOR抑制TE1細胞增殖及遷移

為了探究LncRNA THOR對TE1細胞的影響，在TE1細胞中敲降LncRNA THOR以檢測其對TE1 細胞的影響。si-LncRNA THOR-1和si-LncRNA THOR-2轉染TE1細胞后，通過CCK8實驗結果證實實驗組的細胞增殖受到抑制(圖5)，差異具有統計學意義。劃痕實驗顯示(圖6)，與無意義對照組(si-NC)相比，2個靶點(si-LncRNA THOR-1、si-LncRNA THOR-2)進行轉染的TE1細胞在12 h、24 h、48 h幾個時間位點均表現為遷移能力明顯受到抑制。結果表明，敲降LncRNA THOR能夠抑制TE1細胞增殖及遷移能力。

2.5 敲降LncRNA THOR下調TE1細胞中GIL-1和MYC mRNA和蛋白質的表達水平

siRNA-LncRNA THOR-1和siRNA-LncRNA THOR-2轉染TE1細胞后，與無意義轉染對照細胞(si-NC)相比， GLI-1和MYC mRNA和蛋白質表達水平均下降(P<0.05)(圖7-圖8)。結果表明，敲降LncRNA THOR能夠顯著下調 TE1 細胞中GLI-1和MYC的mRNA及蛋白的表達水平。

3 討論

ESCC是一種常見的惡性腫瘤，其發病隱匿，早期診斷困難是食管癌發病率居高不下的主要原因；而晚期發現的食管癌患者往往已經失去手術治療的最佳時機，放化療的預后均令人堪憂，導致死亡率極難下降。因此，需要尋找ESCC的早期診斷標志物和治療靶點。研究表明，ESCC的發生發展與lncRNA密切相關，許多lncRNA參與了ESCC的疾病進程。Yao等[14]報道發現MALAT-1的上調與ESCC患者的生存率降低有關。抑制MALAT-1可影響ESCC細胞凋亡、遷移/侵襲、集落形成和細胞周期阻滯等。HOTAIR通過誘導啟動子區組蛋白H3K27甲基化，從而降低WIF-1的表達，激活Wnt/catenin信號通路參與ESCC 細胞的增殖和侵襲[15]。LncRNA THOR是近年來新發現的一種非常保守的長非編碼RNA，具有睪丸組織特異性，并廣泛存在于人類多種腫瘤組織中。已經有研究報道LncRNA THOR能夠在基因水平調控多個腫瘤的增殖，LncRNA THOR在腎細胞癌、胃癌、舌鱗狀細胞癌、肝癌等多種腫瘤中呈現異常高表達，并在其發生發展中發揮重要作用。然而，LncRNA THOR與ESCC之間的關系尚未研究。為了探究LncRNA THOR和ESCC之間的關系，本研究首先檢測了LncRNA THOR在ESCC中的表達情況，再利用siRNA敲降LncRNA THOR后檢測ESCC細胞生物學功能的變化。

已有的研究發現腎細胞癌組織標本中LncRNA THOR異常高表達，同樣的發現LncRNA THOR在腎細胞癌細胞高表達[12]。體內外研究均證實，靶向沉默LncRNA THOR可以抑制腎癌細胞的生長、增殖和存活，而過表達LncRNA THOR則可以增強細胞的活力和增殖能力。Song等[16]研究發現LncRNA THOR在胃癌中存在高表達的情況。Yang等[17]檢測到舌鱗狀細胞癌中LncRNA THOR表達上調。體內外研究均證實，敲低LncRNA THOR可以抑制舌鱗狀細胞癌細胞的生長、減少克隆形成和誘導G0/G1阻滯，而過表達LncRNA THOR可以促進細胞的增殖和誘導G0/G1期細胞數量增加。Cheng[18]等通過qRT-PCR檢測發現，LncRNA THOR在肝癌組織中的表達水平相對比正常肝組織呈顯著上調，且LncRNA THOR的表達水平與肝癌復發率和術后生存時間密切相關。該研究進一步證實，沉默LncRNA THOR可顯著抑制肝癌細胞的生長、增殖、克隆形成、轉移、侵襲等能力。然而，LncRNA THOR的異常表達在ESCC發生發展中的具體機制尚不明確。本研究發現在ESCC癌組織和ESCC細胞系TE1和EC109、中LncRNA THOR表達顯著上調，提示LncRNA THOR可能參與ESCC的發生發展過程。 在ESCC細胞系TE1中敲減LncRNA THOR后，通過CCK8和劃痕實驗發現細胞增殖和遷移能力都受到抑制，表明LncRNA THOR能夠參與調節細胞增殖和遷移能力，進而參與ESCC的遷移和侵襲過程。

LncRNA THOR能夠與IGF2BP1結合，并調控其依賴基因IGF2 、GLI-1、MYC等，最終影響腫瘤發生的進展。敲除腎癌細胞中的LncRNA THOR可以顯著下調IGF2BP1依賴基因IGF2、GLI-1和MYC的mRNA和蛋白質表達水平。而過表達LncRNA THOR則可以上調IGF2BP1依賴基因的mRNA和蛋白質表達水平。因此，在腎癌細胞中，LncRNA THOR通過對IGF2BP1相關依賴基因調控，進一步影響腎癌細胞的細胞生物學表現[12]。LncRNA THOR和IGF2BP1在舌鱗狀細胞癌組織中均表達上調，且在mRNA水平上表達呈正相關。LncRNA THOR通過與IGF2BP1相互作用調節IGF2的表達，影響下游信號通路MEK-ERK，進而調控舌鱗狀細胞癌細胞的增殖[17]。本研究發現沉默LncRNA THOR后，TE1細胞中GLI-1和MYC的的 mRNA 及蛋白的表達水平都顯著降低，提示LncRNA THOR可能通過IGF2BP1相互作用調控GLI-1和MYC的表達水平，參與ESCC細胞的細胞增殖和遷移等，從而調控ESCC發展進展。

綜上所述，LncRNA THOR在ESCC中異常高表達，且可能通過IGF2BP1相互作用調控GLI-1和MYC的表達，進而參與ESCC的增殖與遷移過程，但具體調控機制尚需要體內外實驗進一步研究證實。本研究同時發現LncRNA THOR在ESCC中扮演著促癌基因的作用，暗示其可能成為ESCC潛在早期診斷分子標志物及治療靶點。