IL-33調控腫瘤免疫微環境中IFN-γ的生物信息學分析

韓鴻舉 蘇子陽 周玉潔 王 璽

(首都醫科大學基礎醫學院免疫學系，北京 100069)

白細胞介素-33(interleukin-33，IL-33)在抗腫瘤免疫中具有重要作用，可以上調干擾素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)的表達，然而具體機制尚不清楚[1-7]。為了進一步探討IL-33在腫瘤免疫微環境中發揮的抗腫瘤作用和上調IFN-γ的機制，在公共數據庫中下載了結腸癌的轉錄組和肺癌的蛋白組數據，進行數據挖掘。有研究[4]顯示IL-33通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路調控IFN-γ mRNA的穩定性，但是MAPK如何調控mRNA穩定性尚不清楚。通過查閱文獻發現異質性胞核核糖核蛋白D(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein D，HNRNPD或AU-rich element binding factor 1，AUF1)可能介導調控IFN-γ mRNA的穩定性[8-12]。為了證實IL-33是通過下調AUF1從而影響IFN-γ，本研究對IL-33和AUF1表達的相關性進行分析。

1 材料與方法

1.1 數據下載及計算差異表達基因(differentially expressed gene，DEG)

本研究的生物信息數據下載自美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information，NIH)下屬的GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)和臨床蛋白質組腫瘤分析協會(Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium，CPTAC)蛋白和蛋白磷酸化組數據庫(https://cptac-data-portal.georgetown.edu/datasets/)。

下載GEO編號GSE109694結腸癌RNA表達量芯片數據。為了考察IL-33對造血干細胞來源的免疫細胞的影響，選取“St2-/-bone marrow into WT host (St2-/-=> WT)”和 “WT bone marrow into WT host (WT=> WT)”兩組進行分析。使用R語言進行數據處理。數據處理計算差異表達基因(differentially expressed gene，DEG)步驟包括插補空白表達量、去除重復基因、數據分組、數據ENSEMBLID或ENTREZID轉換為基因名SYMBOL、對實驗組和對照組基因表達值循環進行Student’st-test檢驗、數據匯總和分析。使用R語言中的r包“edgeR”中的“DGEList”、“calcNormFactors”、“estimateCommonDisp”、“estimateTagwiseDisp”和“exactTest”函數計算DEG。參考Gong等[13]的方法，在RNA表達量中將FDR<0.05且|lgFC|>1定義為差異基因的篩選標準。將CPTAC數據庫中下載的肺鱗狀細胞癌(lung squamous cell carcinoma，LSCC)蛋白組數據根據IL-33表達量中位數作為劃分臨界值，將病例分為IL-33高表達和低表達兩組?？紤]到蛋白組數據表達量變化較小，將FC=2設定為DEG計算的閾值。計算兩組DEG步驟與GEO數據處理過程相同。使用R語言中的“plot”、“points”和“abline”函數進行火山圖繪制。

1.2 IL-33相關Kaplan Meier生存曲線

使用Kaplan Meier(KM) plotter(https://kmplot.com/analysis/) 在線生存分析工具繪制KM曲線，分析IL-33表達對肺癌、乳腺癌和胃癌患者預后的影響?；騍YMBOL輸入“IL-33”，使用默認中位數(median)劃分病例，生存參數選擇“OS”，跟蹤時間選擇全體(all)。使用OncoLnc(http://www.oncolnc. org/)在線生存分析工具繪制KM曲線，分析IL-33表達對結腸癌患者預后的影響?！皔our favorite gene”中輸入“IL-33”，使用推薦的劃分區間(33∶33)進行患者分組。

1.3 基因本體論(gene ontology，GO)分析及京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析

使用R語言中的r包“clusterProfiler”中的“enrichGO”函數對DEG進行GO富集分析。使用R語言中的r包“ggplot2”中的“barplot”函數對分析結果進行可視化繪制。

使用R語言中的r包“clusterProfiler”中的“enrichKEGG”函數對DEG進行KEGG富集分析。使用R語言中的r包“ggplot2”中的“barplot”函數對分析結果進行可視化繪制。

1.4 繪制蛋白-蛋白互作網絡示意圖

使用STRING(https://string-db.org/)搜尋蛋白質相互作用的在線分析工具繪制DEG的蛋白-蛋白相互作用網絡示意圖(protein-protein interaction network，PPI)。參數設定中最小互作分數(minimum required interaction score)設定為0.9(highest confidence)，隱藏網絡中未連接的節點(hide disconnected nodes in the network)。

1.5 計算蛋白表達相關系數

在CPTAC蛋白組數據中提取目標蛋白表達數據量。使用r包“ggplot2”中的“ggscater”函數繪制散點圖，使用“stat_cor”函數計算相關系數?！癝tat_cor”函數的“method”參數設定為“spearman”。

2 結果

2.1 IL-33的高表達改善多種癌癥生存預后

在1 925例肺癌患者、875例胃癌患者、290例結腸癌患者和3 951例乳腺癌患者中，IL-33表達較高的病例生存期顯著延長(圖1)。在肺癌中HR=0.7，LogrankP<0.001；在胃癌中HR=0.79，LogrankP<0.001；在乳腺癌中HR=0.69，LogrankP<0.001；在結腸癌中LogrankP<0.05。

圖1 IL-33的高表達改善多種癌癥生存預后Fig.1 High expression of IL-33 ameliorates the prognosis for lung, gastric, colon, and breast cancer patients A: results in lung cancer; B: results in gastric cancer; C: results in breast cancer; D: results in colon cancer; IL-33: interleukin-33.

2.2 IL-33在結腸癌腫瘤微環境中上調免疫細胞IFN-γ的表達

經過基于負二項隨機變量的精確檢驗發現177個DEG，其中表達上調基因62個，表達下調基因115個。使用基因表達差異矩陣繪制火山圖(圖2A)?；鹕綀D中FDR<0.05且lgFC>1的基因所對應的點標記為紅色?；鹕綀D中FDR<0.05且lgFC<-1的基因所對應的點標記為綠色。IFN-γ對應的點標記為棕色。IFN-γ的FDR<0.05,lgFC=-3.7。篩選DEG中FDR<0.05且|lgFC|>3的DEG繪制熱圖(圖2B)。

2.3 結腸癌中IL-33導致差異表達基因的GO注釋和KEGG通路富集

對IL-33影響的177個DEG進行生物途徑(biological process，BP)、細胞成分(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)的注釋。選取富集最顯著10個BP、CC和MF結果繪圖(圖3A)。在BP中，可富集到對IFN-γ的反應(Padjust<0.001),對IFN-β的反應(Padjust<0.001)，固有免疫調控(Padjust<0.001),原蟲反應(Padjust<0.001)等。在CC中，DEG主要包含：共生相關空泡(Padjust<0.001),胞外膜捆綁細胞器(Padjust<0.001),宿主細胞胞質(Padjust<0.001)等。在MF中，主要富集到：GTP酶活性(Padjust<0.001),GTP結合(Padjust<0.001),嘌呤核糖核酸結合(Padjust<0.001),核糖核酸結合(Padjust<0.001)等。

使用R語言進行了KEGG信號通路富集分析，選取30個最顯著富集信號通路(圖3B)。細胞對抗原處理和提呈(Padjust<0.001)、NOD樣受體信號通路(Padjust<0.001)、同種異體移植排斥(Padjust<0.001)、移植物抗宿主病(Padjust<0.001)、吞噬體通路(Padjust<0.001)和一型糖尿病(Padjust<0.001)等通路差異有統計學意義。

圖4 差異表達基因蛋白互作網絡分析Fig.4 PPI analysis of DEGPPI: protein-protein interaction network; DEG: differentially expressed gene.

2.4 差異表達基因蛋白互作網絡分析

使用在線PPI繪制工具STRING對177個DEG進行蛋白之間的互作分析(圖4)，發現IL-33影響了IFN-γ(lgFC=-3.71)、NOS2(lgFC=-2.38)、STAT1(lgFC=-1.35)、STAT2(lgFC=-1.01)和CXCL10(lgFC=-2.14)等蛋白的表達，而且IFN-γ與NOS2、STAT1、CXCL10、SOCS1四個蛋白有直接相互作用。

2.5 IL-33在肺癌中與AUF1的表達呈負相關

對以IL-33表達高低作為分組標準并計算的DEG進行火山圖繪制結果見圖5。P<0.05且lgFC>0.3的基因對應的點標記為紅色。P<0.05且lgFC<-0.3的基因對應的點標記為綠色。AUF1的P<0.001，lgFC=-0.36。對DEG進行GO注釋和KEGG分析。GO注釋中BP通路主要包括核糖核蛋白復合體生物合成、核糖體生物合成、非編碼RNA處理等。KEGG分析通路主要富集于細胞內吞作用、剪接體、補體和凝集瀑布等。

圖5 LSCC中IL-33高低表達組的DEG、GO和KEGG分析結果Fig.5 DEG, GO and KEGG analysis results in LSCCLSCC: lung squamous cell carcinoma; IL-33: interleukin-33; DEG: differentially expressed gene; GO: gene ontology; KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; AUF1: AU-rich element binding factor 1.

對LSCC中IL-33與AUF1的蛋白表達進行相關性分析，結果發現IL-33與AUF1的蛋白表達呈負相關(圖6A，r=-0.64，P<0.001)。同時，在LUAD中也對IL-33和AUF1的蛋白表達進行了相關性分析，結果同樣發現IL-33與AUF1的蛋白表達呈現顯著負相關(r=-0.62，P<0.001,圖6B)。

圖6 在LSCC和LUAD中IL-33和AUF1表達呈負相關Fig.6 Expression of IL-33 negatively correlates with AUF1 in LSCC and LUADA: correlation in LSCC; B: correlation in LUAD; IL-33: interleukin-33; AUF1: AU-rich element binding factor 1; LSCC: lung squamous cell carcinoma; LUAD: lung adenocarcinoma.

3 討論

IL-33是IL-1家族成員[14]，主要表達于人角質細胞、內皮細胞和纖維母細胞。IL-33的受體ST2在Th2細胞、肥大細胞和固有淋巴樣細胞2(type 2 innate lymphoid cells，ILC2)上高表達。早期研究[15]顯示IL-33主要在二型免疫應答中發揮作用，對抗腫瘤免疫有負向調控作用，但近年來不斷有新的研究[5-7]顯示IL-33在抗腫瘤免疫中也具有正向調控作用。

在不同癌腫模型[5-7]中關于IL-33的抗腫瘤免疫正向調控作用人們也做了大量工作。在黑色素瘤肺轉移模型中，Lucarini等[7]研究表明IL-33通過嗜酸性粒細胞抑制了黑色素瘤轉移。在結腸癌模型中，Eissmann等[6]發現，IL-33抑制了結腸癌的進展。St2敲除鼠經過azoxymethane (AOM，一種結腸癌模型誘導劑)處理后，癌腫進展明顯較對照組快。Jin等[5]構建了穩定過表達IL-33的H22小鼠肝癌細胞系，將其接種到小鼠中構建小鼠肝癌模型，結果發現相比對照組，過表達IL-33的肝癌進展明顯減慢。

以上結果都說明IL-33在抗腫瘤免疫中發揮重要作用。腫瘤免疫參與的免疫細胞主要包括Th1和自然殺傷(natural killer,NK)細胞，產生的免疫反應稱為1型細胞免疫反應，以IL-12誘導分化為標志。然而IL-33如何調控細胞免疫目前還不太清楚。研究[16]顯示IL-33在Th1免疫反應中依賴轉錄因子T-bet和STAT4。T-bet在Th0向Th1分化過程中起決定作用，而STAT4負責1型免疫反應相關基因轉錄。Th1細胞表面的IL-33受體ST2的表達是一過性的，這也部分解釋了IL-33無法單獨刺激Th1細胞和NK細胞上調IFN-γ表達的原因。IL-33的作用是協助IL-12在Th1細胞和NK細胞中上調IFN-γ表達[4, 17]。Lusty等[18]研究表明STAT4是IL-12激活的下游轉錄因子。IL-12/18聯合刺激時無法進一步增強STAT4的激活水平，說明IL-18通過其他機制增強IL-12的刺激作用。IL-18和IL-33同為IL-1家族成員，可能也有類似的機制。目前認為IL-33輔助IL-12上調IFN-γ表達的信號通路中包含Myd88[3]、MAPKp38[4]和MK2/3[19]等信號轉導分子。

本文對GEO數據庫中的數據進行了挖掘，計算了DEG，發現在結腸癌中IL-33可以影響IFN-γ的表達。本文針對DEG進行了非監督層次聚類、GO分析、KEGG通路富集分析和蛋白網絡相互作用分析，發現IL-33和mRNA穩定性有一定關系。

研究[4]顯示IL-33可以穩定IFN-γ mRNA。IL-33不僅在結腸癌中增加了IFN-γ的表達，在肺癌中也可上調IFN-γ的表達[3]，而且有研究[11]提示IFN-γ mRNA穩定性易受到AUF1調控。因此本研究對CPTAC數據庫中的肺癌患者數據進行挖掘，通過對關鍵DEG包括AUF1進行了分析，確定了AUF1與IL-33的相關關系。AUF1是腺尿核苷酸富集元件(AU-rich element, ARE)結合蛋白[10]，可與熱休克蛋白27、熱休克蛋白70、翻譯起始因子eIF4G、多聚腺苷尾結合蛋白和其他未鑒定的蛋白組分組成AUF1和信號轉導調控復合體(AUF1- and signal transduction-regulated complex，ASTRC)[20]，該復合體可招募并降解含ARE的mRNA。

在真核細胞中轉錄和翻譯是分開的兩個過程，因此遺傳信息從DNA到蛋白的表達過程中機體可在多個節點上進行調控。細胞質中的mRNA水平代表了其轉錄和降解的平衡,真核細胞可通過mRNA結合蛋白調控不穩定mRNA的半衰期,不穩定mRNA包括細胞周期調控組蛋白、原癌基因、細胞因子和淋巴因子等基因翻譯出的mRNA。其中一類不穩定mRNA如IFN-γ的3′UTR含有ARE[21]，易受到mRNA結合蛋白如ASTRC的攻擊[11]。

本研究通過生物信息學分析發現了AUF1在IL-33調控IFN-γ中的重要作用，即IL-33可以通過AUF1調控IFN-γ mRNA穩定性，從而為IL-33作為抗腫瘤免疫細胞因子在臨床上的應用和相關藥物靶點的開發提供了理論依據，下一步將通過實驗進一步驗證。