蛋白激酶Pbk在缺氧神經膠質細胞中的變化及與IGF-1的相關性

王雨晴 陳志剛 李芳芳 張斯佳 羅玉敏 趙海蘋*

(1. 北京中醫藥大學東方醫院腦病科, 北京 100029； 2.首都醫科大學宣武醫院腦血管病研究室， 北京 100053)

神經膠質細胞是神經組織中除神經元以外的另一大類細胞，主要有星形膠質細胞和小膠質細胞等，可以分泌多種神經活性物質。胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factors，IGF-1)又名“促生長因子”，在神經系統的增生、分化和神經功能的調控方面具有重要作用。研究[1-2]顯示腦組織發生缺血缺氧損傷后，IGF-1及其受體表達增加，是腦卒中的血管保護因子，可促進神經元軸突生長改善神經功能[3]。另外，外源性IGF-1能夠改善全腦缺血大鼠及老年小鼠的學習記憶能力，可能與其抑制海馬CA1區細胞凋亡，促進海馬神經細胞增生和神經元產生，提高磷脂酰肌3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B, PKB)即PI3K/Akt信號通路中p-Akt、p-mTOR蛋白的表達相關[4-5]。

MAPK級聯信號通路在細胞的適應、增生、分化、存活、凋亡等方面發揮重要作用。絲-蘇氨酸激酶PDZ連接激酶(PDZ-binding-kinase，Pbk)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MAPKK)家族的新成員，本課題組前期研究[6]證明在腦缺血后的神經元中Pbk的表達被抑制，而缺血后適應可以激活Pbk/p-Akt通路從而產生抗細胞氧化損傷和神經保護的作用。但是，Pbk在低氧條件下小膠質細胞和星形膠質細胞中的變化和作用尚需進一步研究。研究[7-8]顯示IGF-1可能通過MAPK信號通路起到促進細胞增生，發揮神經元的去抑制作用等。同時，基于IGF-1與Akt信號通路的作用[4]，提示IGF-1可能與蛋白激酶Pbk之間存在一定的關聯性，但是其上下游關系尚不清楚。另外，本課題組在前期研究[9]中發現Pbk可以通過抑制組蛋白去乙?；?(histone deacetylases 2, HDAC2)活性調控小膠質細胞的表型轉化。這提示HDAC2與IGF-1之間也可能存在一定的關聯性。因此，本實驗通過培養原代星形膠質細胞和BV2小膠質細胞氧糖剝奪(oxygen and glucose deprivation，OGD)模型探究了缺氧不同時間點后神經膠質細胞的IGF-1以及Pbk、HDAC2的表達情況，并初步探討了三者之間的關系，為將來的機制研究提供線索。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與細胞

SPF級C57BL/6孕鼠，孕齡為16～18 d，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京) 2016-0006, 小鼠小膠質BV2細胞系購于北京協和醫院基礎所細胞中心。

1.2 主要試劑與儀器

試劑：DMEM/F12培養基購于美國Invitrogen公司，Trizol試劑、無RNA酶的水、無RNA酶的糖原購于美國Invitrogen公司，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽[tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride, Tris-HCl]、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)、3-(N-嗎啉基)丙磺酸[3-(N-morpholino)propanesulfonic acid, MOPS]、溴化乙錠(ethidium bromide，EB)購于華美生物工程公司，乙酸鈉、甲醛、氯仿、異丙醇、100%(體積分數)乙醇購于上?；瘜W試劑有限公司，甲醛上樣染液購于美國Ambion公司，瓊脂糖購于生工生物工程有限公司，RNA酶抑制劑購于美國Epicentre公司，SuperScriptTM III反轉錄酶、5×RT緩沖液購于美國Invitrogen公司，2.5 mmol/L dNTP混合液購于芬蘭HyTest公司；2×PCR反應混合物購于美國Arraystar公司。

儀器：潔凈工作臺(上海博迅實業有限公司醫療設備廠)、DK-8D型電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司)、Gene Amp PCR系統(德國Biosystems公司)、ViiA 7 RT PCR系統(德國Biosystems公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 星形膠質細胞的分離

取16～18 d的孕鼠分離胎鼠。放入-20 ℃冰箱內低溫麻醉，斷頭前置預冷的75%(體積分數)乙醇中消毒。超凈臺中取出新生大鼠雙側大腦半球，置于預冷的解剖液中，在解剖顯微鏡下剪開顱骨及硬腦膜，迅速剝除軟腦膜，并去除嗅球、基底核、海馬，去除腦膜和血管組織。將收集的大腦皮質置于預冷的添加了5%(體積分數)胎牛血清的DMEM/F12中，剪碎成組織塊，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用0.25%(質量分數)胰酶+1 mmol/L EDTA的消化液于37 ℃消化25 min，期間反復振搖2次，以血清中止消化，反復吹打使之成為單細胞懸液。離心，棄去上清，D-hank’s 洗滌兩次，過200目的尼龍濾網，收集濾液離心后，棄上清，用完全培養液重懸細胞，接種培養瓶中，37 ℃、5%(體積分數)CO2培養箱中靜置培養，半小時后轉入新培養瓶以去除成纖維細胞。3 d后首次換液去除細胞碎片?；旌仙L12～14 d左右，細胞鋪滿瓶底時，旋緊瓶蓋，石蠟膜封口，于37 ℃的恒溫搖床中以250 r/min的速度振搖約12～16 h，收集經搖床震蕩后的貼壁細胞，以D-Hank’s液沖洗殘留在表面的小膠質細胞和少突膠質細胞，加入新鮮的完全培養液，得到純度較高的星形膠質細胞。

1.3.2 小膠質細胞的培養

小鼠小膠質BV2細胞系購于北京協和醫院基礎所細胞中心，于DMEM培養液[10%(體積分數)胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 μg/mL鏈霉素]中，在37 ℃、5%(體積分數) CO2培養箱中培養，觀察細胞生長情況。待細胞達到70%～80%融合時，輕輕搖動培養瓶，懸浮未貼壁細胞，吸出培養液，加入PBS清洗。吸去PBS加入0.25%(質量分數)胰酶，消化1 min 左右，加入完全培養液終止消化。轉移到15 mL 無菌離心管中，1 000 r/min離心5 min。棄上清，加入適量培養液將細胞吹打成單細胞懸液，1∶3傳代。

1.3.3 神經膠質細胞OGD模型與分組

構建OGD模型，將細胞換至無糖培養液并置于密閉缺氧盒中，向盒內持續通入95%(體積分數)N2+5%(體積分數)CO2的混合氣體5 min，使盒內的空氣被完全置換成不含氧氣的混合氣體。將缺氧盒置于37 ℃培養箱中，分別于OGD處理后不同時間點收集細胞。星形膠質細胞和小膠質細胞各分為4組，分別為對照組、OGD 1 h組、OGD 3 h組和OGD 6 h組，每組6孔。

1.3.4 RT-PCR法檢基因表達水平

采用反轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法進行檢測。收集不同時間點的神經膠質細胞用Trizol法進行 RNA提取，使用NanoDrop?ND-1000測定RNA濃度和純度。根據SuperScriptTM Ⅲ反轉錄試劑盒進行cDNA合成。使用Primer 5.0(英駿生物技術有限公司)設計引物，β-actin mRNA作為對照。進行實時定量PCR,引物序列詳見表1。

表1 引物序列

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 OGD后小膠質細胞和星形膠質細胞IGF-1的表達情況

細胞缺氧缺糖損傷后，IGF-1在小膠質細胞中的表達水平為先升高后下降，組間比較差異有統計學意義(F=6.41，P=0.008)，兩兩比較顯示，OGD處理后6 h 下降較為明顯，與其他組比較，差異有統計學意義(P<0.05，圖1A)。IGF-1在星形膠質細胞中的表達升高，組間比較差異有統計學意義(F=3.701，P=0.029)，兩兩比較顯示，OGD 處理后3 h和6 h明顯高于對照組(P<0.05，圖1B)。

圖1 兩種膠質細胞氧糖剝奪后不同時間點IGF-1的表達Fig.1 Expression of IGF-1 at different time points after oxygen and glucose deprivation of the two kinds of glial cellsA: expressions of cytokine IGF-1 in microglia after 1 h, 3 h and 6 h of oxygen and glucose deprivation; B: expressions of cytokine IGF-1 in astrocyte after 1h, 3 h and 6 h of oxygen and glucose deprivation. *P<0.05, **P<0.01 vs control. IGF-1: insulin-like growth factors-1; OGD: oxygen-glucose deprivation. Each group n=6.

2.2 OGD后小膠質細胞和星形膠質細胞中Pbk的表達情況

小膠質細胞缺氧缺糖1、3和6 h后Pbk的mRNA表達逐漸下降，組間比較差異有統計學意義(F=74.1，P<0.001)，兩兩比較顯示，處理后3 h和6 h與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05，圖2A)。星形膠質細胞缺氧缺糖1、3和6 h后Pbk的mRNA表達水平逐漸升高，組間比較，差異有統計學意義(F= 14.34，P<0.001)，兩兩比較顯示，OGD處理后3 h和6 h與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05，圖2B)，缺氧缺糖損傷抑制了Pbk在小膠質細胞中的表達，增加了Pbk在星形膠質細胞中的表達，以OGD處理后3 h和6 h最為顯著。

圖2 Pbk在兩種膠質細胞氧糖剝奪后不同時間點的表達水平Fig.2 Expression levels of Pbk at different time points after oxygen and glucose deprivation of the two kinds of glial cellA: expressions of Pbk in microglia after 1, 3 and 6 h of oxygen and glucose deprivation, ***P<0.001 vs control. B: expressions of Pbk in astrocyte after 1, 3 and 6 h of oxygen and glucose deprivation, ***P<0.001 vs control. Each group n=6. Pbk: PDZ-binding -kinase; OGD: oxygen-glucose deprivation.

圖3 HDAC2在兩種膠質細胞氧糖剝奪后不同時間點的表達水平Fig.3 Expression of HDAC2 at different time points after after oxygen and glucose deprivation of the two kinds of glial cellsA: expressions of signal molecule HDAC2 in microglia after after 1, 3 and 6 h of oxygen and glucose deprivation, ***P<0.001 vs control. B: expressions of signal molecule HDAC2 in astrocyte after 1, 3 and 6 h of oxygen and glucose deprivation, **P<0.01, *** P<0.001 vs control. Each group n=6. HDAC2: histone deacetylase 2; OGD: oxygen-glucose deprivation.

2.3 OGD后小膠質細胞和星形膠質細胞中HDAC2的表達情況

小膠質細胞缺氧缺糖1、3和6 h后HDAC2的mRNA表達逐漸下降，組間比較差異有統計學意義(F=27.4，P<0.001)，兩兩比較顯示，OGD處理后6 h 與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05，圖3A)。星形膠質細胞缺氧缺糖1、3和6 h后HDAC2的mRNA表達水平逐漸升高，組間比較差異有統計學意義(F=8.463，P=0.002)，兩兩比較，OGD處理后3 h和6 h與對照組相比，差異均有統計學意義(P<0.05，圖3B)。

2.4 OGD后兩種膠質細胞中IGF-1和信號分子Pbk、HDAC2的相關性

小膠質細胞和星形膠質細胞缺氧缺糖損傷后，信號分子Pbk和HDAC2的表達與細胞因子IGF-1的表達均呈正相關關系(P<0.05，圖4)。

圖4 小膠質細胞和星形膠質細胞中信號分子與細胞因子的相關性分析Fig.4 Correlation analysis between signaling molecules and cytokines in microglia and astrocyteA: correlation between the signaling molecule Pbk and the cytokine IGF-1 in microglia; B: correlation between signal molecule HDAC2 and cytokine IGF-1 in microglia; C: correlation between the signaling molecule Pbk and HDAC2 in microglia; D: correlation between the signaling molecule Pbk and the cytokine IGF-1 in astrocyte; E:correlation between signal molecule HDAC2 and cytokine IGF-1 in astrocyte; F: correlation between the signaling molecule Pbk and HDAC2 in astrocyte; IGF-1: insulin-like growth factors; Pbk: PDZ-binding-kinase; HDAC2: histone deacetylase 2.

3 討論

本研究結果顯示在缺糖缺氧的情況下，小膠質細胞中IGF-1的mRNA轉錄水平降低，星形膠質細胞中IGF-1的mRNA轉錄水平增加，且均與信號分子Pbk以及HDAC2的變化趨勢相同。盡管在兩種細胞中IGF-1基因表達呈相反趨勢，但是在兩種膠質細胞中Pbk、HDAC2均與IGF-1的轉錄水平呈顯著正相關。

研究[10-11]顯示兩種膠質細胞兼具神經保護或神經毒性作用，因此分泌的細胞因子也具有不同的作用。IGF-1在缺氧缺血性腦損傷中可以參與神經形成及其髓鞘化，促進血管新生，減少細胞凋亡，起到神經保護作用[12-13]。然而其上游調節機制目前尚不明晰。

組蛋白去乙?；?histone deacetylases, HDACs)通過調控組蛋白、非組蛋白的乙?；?，對于基因轉錄的穩態維持起到重要作用。HDAC2屬于經典的HADACs家族I類成員，在細胞核內與共同轉錄抑制子結合，從而使染色體組蛋白、非組蛋白去乙?；种妻D錄。研究[14-15]顯示HDAC2可調節細胞存活及神經元可塑性，有望作為腦卒中后神經功能恢復的治療靶點。HDAC抑制劑(HDAC inhibitor, HDACi)也被證實對腦缺血模型具有一定的神經保護作用[16-17]。在骨關節炎以及缺氧所致肺動脈高壓等病理基礎研究[18]中顯示，組蛋白的乙?；綄GF-1的表達起到調控作用。但在腦缺血缺氧性損傷中的研究尚不充分。

本研究結果提示在膠質細胞缺氧缺糖損傷早期，信號分子Pbk、HDAC2以及細胞因子IGF-1在小膠質細胞中的表達均下降，在星形膠質細胞中的表達均上升。本研究相關性分析結果提示，信號分子與細胞因子的表達呈正相關。

本課題組前期研究[6]顯示Pbk在正常情況下即與HDAC1/2相結合，腦缺血再灌注損傷后隨著時間的推移其結合程度增加。在小鼠腦缺血修復期，Pbk可以通過結合HDAC1/2增強其磷酸化水平，降低酶的活性，進而增加小膠質細胞中組蛋白的乙?；?，促進小膠質細胞從神經毒性的M1型向神經保護的M2型轉化，有助于神經功能恢復，是潛在的內源性HDAC1/2抑制劑[6]。結合這一研究基礎，本實驗中OGD處理后小膠質細胞Pbk的表達降低，從而導致HDAC2的磷酸化水平降低，HDAC2的活性增強，抑制了組蛋白乙?；?，從而導致IGF-1的分泌減少；相反，OGD處理后星形膠質細胞Pbk的表達水平升高，從而導致HDAC2的磷酸化水平升高，HDAC2的活性降低，促進了組蛋白乙?；?，從而導致IGF-1的分泌增多。這提示在缺血缺氧早期如能盡早干預，合理提高Pbk的表達，增加Pbk/HDAC的結合程度，提高組蛋白乙?；?，有助于促使IGF-1的分泌，促進神經血管新生。由此筆者推測，在腦組織缺血缺氧性損傷后，可通過激活Pbk/HDAC2/IGF-1這一信號通路起到神經保護作用。

綜上所述，本實驗結果提示缺氧缺糖損傷顯著促進了星形膠質細胞的IGF-1表達，同時抑制了小膠質細胞的IGF-1表達，Pbk及HDAC2可能參與到膠質細胞分泌神經營養因子的過程，為進一步研究缺血后神經保護機制提供了基礎。未來的研究可繼續探討Pbk以及HDACs參與缺血后神經因子分泌的機制以及其他的調節通路，為臨床轉化提供更多可干預的分子靶點。