基于線粒體Cyt b基因和CR序列的養殖貉(Nyctereutes procyonoides)種群遺傳多樣性和結構分析

魏宏達 李 波，2，3* 魏 來 劉志平 姜春明 史迎秋 徐艷春，2，3*

(1.東北林業大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.國家林業和草原局野生動植物檢測中心，哈爾濱，150040；3.國家林業和草原局野生動物保護與利用工程技術研究中心，哈爾濱，150040；4.哈爾濱華隆藍狐育種有限公司，哈爾濱，150040)

貉(Nyctereutesprocyonoides)隸屬于食肉目(Carnivora)，犬科(Canidae)，犬亞科(Caninae)，貉屬，原產于東亞地區；20世紀初期作為經濟動物引入歐洲[1-2]。貉分為6個亞種：俄羅斯和中國東北的烏蘇里亞種(N.p.ussuriensis)、朝鮮半島亞種(N.p.koreensis)、中國南部和越南北部的指名亞種(N.p.procyonoides)、云南的滇北亞種(N.p.orestes)、北海道亞種(N.p.albus)、日本亞種(N.p.viverrin-us)[3-5]。我國20世紀70年代開始引入野生貉種群(烏蘇里亞種為主)開展規?；Z養繁殖[6]。1990年由野生型貉培育出白色型貉，命名為吉林白貉[7]；2006年山東臨沂飼養種群中出現了紅褐色型貉[8]。這豐富了養殖貉種群的色型，提升了其經濟價值，使其成為我國重要經濟動物之一。但經過50年的人工飼養和繁育、無新野生個體引入、遺傳漂變等因素可能導致貉種群遺傳多樣性水平下降，近交衰退的幾率增加。為此有必要徹底調查養殖貉種群遺傳多樣性水平和遺傳結構，溯源其母系起源，這有助于制定科學的遺傳管理方案，有利于養殖種群的可持續發展。

國內對于貉種群遺傳學研究包括中國貉種群的亞種分類：隨機擴增多態DNA分析結果表明中國貉分為4組：廣西、安徽、陜西、云南—越南[9]；線粒體DNA(mtDNA)限制性內切酶分析結果說明分布于華北和陜西的貉種群應各自獨立為亞種[10]。研究還顯示貉毛色變化與多個基因的多態性、突變和表達相關：黑素皮質素受體1(MC1R)、鼠灰色基因(Agouti)、白色基因(KIT)[11-13]。國際上研究了野生貉種群遺傳多樣性和遺傳結構：線粒體控制區(CR)分析表明俄羅斯貉種群可以劃分為2個mtDNA世系[14]；16個微衛星分析結果說明歐亞大陸種群和日本島嶼種群間有顯著的遺傳分化，大陸種群可分為朝鮮半島南部、中國—俄羅斯、越南3個亞群，且其種群遺傳多樣性水平依次遞減[15]?；诩毎豣(Cytb)基因的貉系統地理學研究說明該物種存在多個冰期避難所，韓國和日本貉種群間沒有發生基因交流[16]?？傊?，由于采集樣本難以全面覆蓋各地理種群，國內貉種群的種下分類及與國外鄰近地區種群的關系還需進一步分析。本研究利用非損傷性技術收集了東北和華北地區養殖種貉的毛樣，測定了其線粒體Cytb基因和CR部分序列；結合GenBank中已知的同源序列綜合分析了國內貉養殖種群的遺傳多樣性和遺傳結構，揭示了其母系起源。

1 材料和方法

1.1 材料

利用非損傷性技術收集了黑龍江養殖場野生型貉102只、紅褐色型貉13只、白色型貉5只和河北養殖場野生型貉40只的毛樣本。采集毛樣品多數有毛囊，放入取樣袋中密封、-20℃保存備用。

1.2 PCR擴增與測序

試驗材料經預處理后利用蛋白酶K消化，后用基因組提取試劑盒(上海百賽生物工程技術有限公司)提取和純化總DNA。利用引物L14724/H15915[16]和NycDLF0/NycDLR01[14]分別擴增貉線粒體Cytb基因和CR部分序列。PCR反應在50 μL體系中進行，包括2×EasyTaqSuperMix(Transgen，北京)25 μL，正、反向引物(10 pmol/μL)各1 μL，DNA模板5 μL，滅菌去離子水 18 μL。擴增采用PE9700型和2400型DNA擴增儀(PE，美國)，PCR擴增程序：94℃預變性3 min，94℃變性45 s，44℃/58.5℃(Cytb/CR)退火45 s，72℃延伸90 s/60 s(Cytb/CR)，擴增35個循環，最后72℃延伸10 min/5 min(Cytb/CR)。PCR擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離(220 v/25 min)。電泳后將PCR產物送至哈爾濱擎科生物科技有限公司，利用原擴增引物進行雙向測序。

1.3 數據分析

從GenBank下載66條同源序列：烏蘇里亞種CR序列30條(JF809819-JF809848)，烏蘇里亞種Cytb基因5條(JX099862-JX099866)，朝鮮半島亞種Cytb基因8條(JX099854-JX099861)，日本亞種Cytb基因17條(JX099869-JX099870、JX099872-JX099880、JX09 9884-JX099889)，北海道亞種Cytb基因4條(JX09 9871、JX099881-JX099883)，指名亞種Cytb基因2條(JX099867、JX099868)。將實驗所得Cytb基因和CR序列峰圖導入DNAstar軟件包的Seqman程序進行拼接，對內部位點進行人工校對，并與下載的貉同源序列進行對比確定變異位點。利用MEGA 5.2.1[17]軟件計算Cytb基因和CR序列的堿基組成。利用DNAsp 6[18]軟件分析確定單倍型、計算單倍型數(haplotype number，H)、單倍型多樣性(haplotype diversity，Hd)、核苷酸多樣性(nucleotide diversity，Pi)以及平均核苷酸差異(average number of nucleotide differences，K)、多態位點數(number of polymorphic sites，S)等數據。

選用最大似然法(maximum likelihood，ML)和貝葉斯推論法(Bayesian inference，BI)進行系統發育分析。在MEGA 5.2.軟件中計算核苷酸最佳替代模型，并根據貝葉斯信息準則(Bayesian information criterion，BIC)選擇最佳模型——Hasegawa-Kishino-Yano+G(HKY+G)[19]。利用IQ-TREE構建ML樹[20]，自舉檢驗值(bootstrap，BS)由1 000次重復檢驗獲得；使用軟件MrBayes 3.2.1[21]構建貝葉斯樹，主要參數包括：將馬爾可夫鏈運行2 000 000代，每100代記錄1次樹，舍棄最先生成的25%樹，由后驗概率(posterior probabilities，PP)評價其置信度。2種樹都以北極狐線粒體基因組中的同源序列作為外群(序列號NC_026529)。

2 結果

2.1 序列特征和單倍型

實驗測得158條Cytb基因序列(1 140 bp)。平均堿基組成：29.58% A、13.75% G、28.64% C、28.03% T，A+T含量(57.61%)高于C+G含量(42.39%)。在1 140 bp中包含15個變異位點(1.36%)，其中簡約信息位點13個，單突變位點2個。實驗測得145條CR序列(659 bp)。平均堿基組成：26.93% A、17.29% G、27.39% C、28.39% T，A+T含量(55.32%)高于C+G含量(44.68%)。在659 bp中包含19個變異位點(2.88%)，其中簡約信息位點17個，單突變位點2個。

158條Cytb基因序列定義了5個單倍型，其中有3個與俄羅斯產烏蘇里亞種共享單倍型(CH1、CH2、CH3)，2個新單倍型(CH4、CH5)。養殖種群優勢單倍型為CH1(48.73%)。145條CR序列定義了6個單倍型，其中有4個與俄羅斯產烏蘇里亞種共享單倍型(DH1、DH2、DH3、DH4)，2個新單倍型(DH5、DH6)。種群優勢單倍型為DH1(67.59%)，單倍型CH5-DH5來自黑龍江養殖場。

2.2 種群遺傳多樣性

貉亞種種群及我國養殖種群Cytb基因核苷酸多樣性(Pi)及平均核苷酸差異(K)等信息見表1。養殖種群的單倍型多樣性為(0.637±0.020)，核苷酸多樣性為(0.523±0.009)%，平均核苷酸差異為5.96。國內養殖貉種群Cytb基因核苷酸多樣性和平均核苷酸差異均略低于產于俄羅斯的烏蘇里亞種野生種群(0.596%和6.800)，高于其他4個亞種的野生種群。

表1 貉Cyt b基因的遺傳多樣性參數

俄羅斯烏蘇里貉野生種群及我國養殖種群CR單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)及平均核苷酸差異(K)等信息見表2。國內養殖種群單倍型多樣性為(0.500±0.042)，核苷酸多樣性為(0.982±0.071)%，平均核苷酸差異為6.46。我國東北與華北地區的貉養殖種群遺傳多樣性水平一致，但都明顯低于同亞種的俄羅斯野生種群。

表2 貉CR序列的遺傳多樣性參數

國內養殖的野生型、白色型和紅褐色型貉種群單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(Pi)及平均核苷酸差異(K)等信息見表3。Cytb基因和CR序列2種分子標記分析結果都表明白色型遺傳多樣性水平略高于野生型，這應與白色型樣本量偏小有關。紅褐色型貉單倍型多樣性和核苷酸多樣性都顯著低于野生型貉，涉及的Cytb基因和CR序列單倍型各自均只有2個，優勢單倍型為HC2-DH2(92.30%)。這說明紅褐色型貉主要是單一單倍型的毛色基因突變而來。

表3 野生型、白色型和紅褐色型貉種群遺傳多樣性參數

2.3 種群遺傳結構

基于Cytb基因和CR序列單倍型構建最大似然樹(ML)及貝葉斯樹(BI)，除置信度不同，2種樹的拓撲結構大致相同(圖1，圖2)?；贑ytb基因的系統發育樹說明東北亞地區分布的野生貉種群可分化為4個mtDNA世系：越南的指名亞種為世系1；日本亞種與北海道亞種獨自組成世系2，與大陸種群(烏蘇里亞種、朝鮮半島亞種、指名亞種)差異明顯；7個朝鮮半島亞種單倍型與4個烏蘇里亞種單倍型組成世系3；1個朝鮮半島亞種單倍型與2個烏蘇里亞種單倍型組成世系4。這說明朝鮮半島亞種與烏蘇里亞種有緊密的系統發育關系。國內養殖貉種群有4個Cytb基因單倍型均勻分布與3、4世系，與俄羅斯產烏蘇里貉有緊密的系統發育關系，還有1個單倍型(CH5)分布于1世系，與越南產指名亞種有更近的親緣關系?；贑R序列的系統發育樹表明俄羅斯烏蘇里貉野生種群和國內養殖種群可分為A、B、C 3個mtDNA世系，B與C世系有更近的親緣關系。A世系(BS=67%，PP=51)包含2個共享優勢單倍型(DH1和DH4，頻率62.87%)，B世系(BS=37%，PP=71)僅有單倍型DH5，C世系(BS=96%，PP=82)含有2個共享單倍型(DH2和DH3)和1個新單倍型(DH6)。由于單倍型CH5與DH5來自同一個體，這說明Cytb基因和CR序列得出的國內養殖貉種群遺傳結構已一致。同時，也表明國內養殖的貉種群多數屬于烏蘇里亞種，極少數個體屬于指名亞種。

3 討論

遺傳變異的程度反映物種進化潛力的大小，決定了物種的生存能力[22-23]。本研究利用線粒體Cytb基因和CR序列評估國內養殖貉種群遺傳多樣性水平。結果顯示，盡管養殖貉種群Cytb基因遺傳多樣性水平與俄羅斯同亞種的相近，但CR區上顯著低于后者。這與2種分子標記的進化速率不同有關：Cytb基因進化速率適中，適合研究種內、種間、科間的系統發育關系[24]；CR區因選擇壓力小而進化速率快，適合研究親緣關系較近的群體[25]。因而，CR區的分析結果更能體現養殖貉種群遺傳多樣性的真實水平。Grant等[26]利用單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多樣性(Pi)評估種群遺傳多樣性水平高低的臨界值分別是0.5和0.5%。該標準也被用于研究哺乳動物種群遺傳多樣性，例如鵝喉羚(Gazellasubgutturosa)[24]、淮南豬(Susscrofa)[27]。根據該標準養殖貉種群單倍型多樣性處于臨界點、核苷酸多樣性處于較高水平。這種遺傳多樣性模式可能主要是由奠基者效應導致的。養殖貉種群建群時個體數偏少，缺乏遺傳管理的繁殖模式促使原來有限的單倍型丟失的風險增加，但遺傳漂變造成核苷酸多樣性丟失要緩慢得多。同時，以生產性能作為單一選育指標的繁殖模式作用下，種群內會不可避免地發生近交，從而造成遺傳多樣性的丟失和個體適合度下降[28-29]。

紅褐色型貉遺傳多樣性水平顯著低于其他2種色型，涉及的優勢單倍型為CH2-DH2。這與該色型產生模式——由毛色基因突變獲得新色型，依賴近親繁殖擴繁種群數量[8，30]是一致的。白色型貉種群遺傳多樣性水平略高于野生型貉，可能是因為取樣存在偏差。此外，吉林白貉的色型為雜合顯性，近親交配會出現基因純合致死現象[31]也是不容忽視的因素。因此，為維持養殖貉種群的質量，建議在保證生產性能的基礎上將遺傳多樣性變化引入種群遺傳管理中。當種群遺傳多樣性和近交衰退達到臨界值時考慮引入具有新基因型的野生貉改良現有種群。

單倍型分析顯示，國內養殖貉種群與俄羅斯野生種群間存在3個Cytb基因和4個CR序列優勢共享單倍型，這說明二者同為烏蘇里亞種[32]、種群間有緊密的系統發育關系。野生貉種群易受環境因素限制，活動范圍較小[33]。本研究還發現養殖種群的Cytb基因單倍型CH5與越南產的貉指名亞種單倍型親緣關系較近。這表明早期建群引種過程中可能偶然引入了華南地區分布的指名亞種?；贑ytb基因和CR序列系統發育關系分析得出了相同的結果，即養殖貉種群來自3個mtDNA世系。部分世系劃分的置信度偏低，這與選取的線粒體序列片段較小有關，增加片段長度可能會提高置信度[34]。相較于俄羅斯的烏蘇里貉，國內養殖貉種群建群時個體的涵蓋度較廣，不同世系個體的交配繁殖，會有效抑制近交衰退的效應。

綜上分析，我國養殖貉種群遺傳基礎較好，但明顯低于俄羅斯野生烏蘇里貉種群，且已經出現遺傳多樣性下降的跡象。需要監控種群遺傳多樣性的變化，引入具有新基因型的野生貉種，制定科學的交配模式，避免近交衰退。