2019年廣州市甲型H1N1流感病毒全基因組序列的遺傳特征分析

曹 藍，吳 迪，陳藝韻，曾 慶，夏 丹，陸劍云，狄 飚，張周斌，李魁彪

長期以來，季節性流感威脅著人類健康，每年造成嚴重的人群發病和死亡。甲型H1N1流感病毒自2009年首次出現以來，由于不斷快速的發生基因變異，已代替了原季節性H1N1流感而持續流行。Mi L等[1]在對1977年以來全球H1N1流感病毒抗原進化模型的研究中發現，在8個主要進化模式中有6個進化模式起源于亞洲，進一步發現，我國南方地區H1N1流感病毒的進化要早于北方地區，提示南方地區H1N1流感病毒在我國H1N1流感傳播進化過程起到重要作用。而廣州市地處華南地區，是我國重要的經濟發展中心，也是包括H1N1流感在內多種傳染病流行的重要地區。早期研究發現，廣州市流感流行呈現雙峰的流行特點，甲型H1N1流感和季節性H3N2流感交替出現[2]，同時甲型H1N1流感病毒也是近期廣州市流感疫情的主要病原[3]。既往的研究中重點對HA和NA基因進行了變異分析，而對甲型H1N1基因組全序列的分子進化研究相對較少，因此本研究選取7株2019年廣州市甲型H1N1流感流行株進行了全基因組測序，為全面掌握近期廣州市甲型H1N1流感病毒的分子流行病學特點提供研究數據。

1 材料與方法

1.1毒株來源 收集2019年廣州市流感監測哨點醫院流感樣病例和社區流感暴發疫情病例的呼吸道標本，通過熒光定量RT-PCR方法進行甲型H1N1、甲型H3N2和乙型流感病毒核酸檢測(試劑盒購于江蘇碩世生物科技公司)，并將流感陽性標本接種MDCK細胞系進行病毒分離，培養產物經過血凝實驗-血凝抑制試驗(HA-HI)對流感病毒培養物進行鑒定(血球為自制豚鼠血，血清由中國疾病預防控制中心提供)。根據分離時間的不同，本研究中隨機選取7株甲型H1N1流感病毒進行全基因組測序。

1.2全基因組序列測定 參考Deng YM等[4]關于流感病毒全基因組測序的方法，并參考近期甲型H1N1流感病毒各基因全長序列，應用Oligo 6軟件設計甲型H1N1流感病毒全序列各基因片段全長測序引物(引物由廣州天一輝遠生物公司合成)，見表1。通過RT-PCR方法擴增HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS全長序列，陽性鑒定產物送至廣州天一輝遠生物公司，通過ABI 3730進行病毒一代測序。

表1 甲型H1N1流感病毒各基因片段擴增引物Tab.1 Amplification primers for gene fragments of the avian influenza A(H1N1)pdm09 virus

1.3分子特征分析 通過DNA Star7.1軟件拼接全序列各基因片段，同時對各基因進行同源性分析。采用MEGA 6.0軟件，以基因ORF為基本單元，對不同進化分支變異氨基酸進行分析。

1.4遺傳進化分析 以GISAID數據庫中歷年WHO推薦的甲型H1N1流感病毒疫苗株各基因片段作為參比序列(A/Guangdong-Maonan/1536/2019 (H1N1)、A/Hawaii/70/2019(H1N1)、A/ Brisbane/02/2018 (H1N1)、A/Michigan/45/2015 (H1N1)、A/California/7/2009 (H1N1)、A /Christchurch/16/2010 (H1N1)、A/Brisbane/59/2007 (H1N1)、A/Solomon/Islands/3/2006 (H1N1)、A/New/Caledonia/20/1999 (H1N1)等)。使用MEGA 軟件繪制各基因遺傳進化樹，參數設置為：Neighbor-joining法(參數設置為1 000 replications)及Maximum composite likelihood model核苷酸替代模型。

2 結 果

2.1總體情況 2019年累計從10 541份監測標本中檢測到甲型H1N1流感陽性標本703份，其中分離甲型H1N1流感毒株70株(均感染MDCK細胞經一代培養)。本研究中7株病毒中，5株分離自流感監測病例，2株分離自流感暴發疫情病例。2株分離于2019年1月，2株分離于2019年3月，2株分離于2019年6月，1株分離于2019年12月。

2.2全基因組序列測定 全序列各基因擴增產物經毛細管電泳鑒定，經過序列拼接，獲得全基因各片段開放閱讀框序列(HA基因：1 701 bp、NA基因：1 410 bp、PB2基因:2 280 bp、PB1基因:2 274 bp、PA基因：2 151 bp、NP基因：1 497 bp、M1基因:759 bp、NS1基因：693 bp)。7株病毒全基因序列中，核苷酸同源性最高為PB2基因(98.8%～99.9%)，最低為NA基因(97.3%～99.2%)，氨基酸同源性最高為PB2蛋白(99.3%～100%)，最低為NA蛋白(96.4%～99.4%)，全基因組同源性見表2。

表2 2019年廣州市H1N1流感分離株全序列基因的同源性分析Tab.2 Sequence similarity analysis of whole genes from novel influenza A (H1N1)pdm09 isolates in Guangzhou in 2019

2.3遺傳進化分析 總體上，不同月份的H1N1流感分離株按時間分布，分別于A/Michigan/45/2015 (H1N1)、A/Brisbane/02/2018 (H1N1)、A/Guangdong-Maonan/1536/2019 (H1N1)、A/Hawaii/70/2019(H1N1)疫苗株聚為一簇，特別是2019年6月份以后的H1N1分離株與世界衛生組織2020-2021年推薦使用的疫苗推薦株A/Guangdong-Maonan/1536/2019 (H1N1)親緣關系最近。分離于哨點醫院流感樣癥狀監測病例的毒株與社區流感暴發疫情的毒株歸屬于同一進化分支。全基因組遺傳進化樹顯示，未發現不同基因來源的基因重配現象。

圖1 2019年廣州市甲型H1N1流感分離株HA基因遺傳進化樹Fig.1 Genetic evolution analysis of HA genes from novel influenza A (H1N1)pdm09 isolates in Guangzhou in 2019

圖2 2019年廣州市甲型H1N1流感分離株NA基因遺傳進化樹Fig.2 Genetic evolution analysis of NA genes from novel influenza A (H1N1)pdm09 isolates in Guangzhou in 2019

圖3 2019年廣州市甲型H1N1流感分離株PB2基因遺傳進化樹Fig.3 Genetic evolution analysis of PB2 genes from novel influenza A (H1N1)pdm09 isolates in Guangzhou in 2019

圖4 2019年廣州市甲型H1N1流感分離株PB1基因遺傳進化樹Fig.4 Genetic evolution analysis of PB1 genes from novel influenza A (H1N1)pdm09 isolates in Guangzhou in 2019

圖5 2019年廣州市甲型H1N1流感分離株PA基因遺傳進化樹Fig.5 Genetic evolution analysis of PA genes from novel influenza A (H1N1)pdm09 isolates in Guangzhou in 2019

圖6 2019年廣州市甲型H1N1流感分離株NP基因遺傳進化樹Fig.6 Genetic evolution analysis of NP genes from novel influenza A (H1N1)pdm09 isolates in Guangzhou in 2019

圖7 2019年廣州市甲型H1N1流感分離株M基因遺傳進化樹Fig.7 Genetic evolution analysis of M genes from novel influenza A (H1N1)pdm09 isolates in Guangzhou in 2019

圖8 2019年廣州市甲型H1N1流感分離株NS基因遺傳進化樹Fig.8 Genetic evolution analysis of NS genes from novel influenza A (H1N1)pdm09 isolates in Guangzhou in 2019

2.4全基因分子特征分析 HA蛋白抗原位點分析結果顯示，與2020-2021年疫苗推薦株A/Guangdong-Maonan/1536/2019 (H1N1)相比，01336、04163、04171分離株發生I202T變異，14130、14137、30390分離株發生D204A變異。大部分毒株HA蛋白有7個糖基化位點，04171分離株發生104-NGT糖基化位點缺失。在NA蛋白神經氨酸酶抑制劑耐藥位點上，所有分離株未發生耐藥突變。

根據全基因進化樹結果顯示，A/Guangzhou/00661/2019 (H1N1)、A/Guangzhou/14130/2019 (H1N1)、A/Guangzhou/14137/2019 (H1N1)和A/Guangzhou/30309/2019 (H1N1)毒株全基因片段均與我國2020-2021年疫苗推薦株A/Guangdong-Maonan/1536/2019 (H1N1)歸屬同一進化分支，對上述4株分離株毒株全基因氨基酸位點與另3株分離株進行變異分析，結果顯示，除PA、M1、M2和NS2蛋白外，其余蛋白均有不同數量的相同特異性氨基酸突變，見表3。同時對兩株流感疫情分離株A/Guangzhou/14130/2019 (H1N1)和 A/Guangzhou/14137/2019 (H1N1)進行全基因氨基酸變異位點特異性分析顯示，兩毒株具有HA-K188E、NA-I40T、PB1-M646L、NS1-I145V等共同的氨基酸變異位點。

表3 同分支分離株基因組特異性氨基酸變異分析Tab.3 Analysis of genome specific amino acid variations in homocladistic isolates

3 討 論

自2017年開始，WHO推薦北半球使用的3株H1N1疫苗株(A/Michigan/45/2015 (H1N1)(2017-2019)、A/ Brisbane/02/2018 (H1N1)(2019-2020)、A/Guangdong-Maonan/1536/2019 (H1N1)(2020-2021))親緣關系較近，遺傳進化上不斷進化，2020-2021年疫苗株與2019年6月之后的流行株在全基因組上位于同一遺傳進化簇上，提示2020年下半年啟動使用的疫苗株與流行株匹配性較好。但該分支中00661毒株分離于2019年1月，說明廣州地區甲型H1N1流感病毒流行的復雜性，不排除較早期流行株與近期流行株共同流行的情況，進而存在病毒重配風險，因此及時監測流行的變異情況、評估疫苗株與流行株的匹配性尤為重要。

廣州流感流行表現為一年兩次的流行高峰，本研究發現6月份以后的流行株全基因組序列在遺傳進化上與疫苗株(2020-2021)共同形成獨立進化分支，進一步氨基酸位點分析也顯示，該分支分離株與疫苗株具有多個位點相同的特異性氨基酸突變，揭示2019年下半年流行株與疫苗株匹配性較好的分子基礎。本研究中2株流感疫情流行株與門診監測流行株高度同源，進化起源相同。但對2株疫情分離株全基因組氨基酸變異分析顯示，在HA、NA、PB1和NS1蛋白存在不同于監測毒株的特異性氨基酸變異，這些位點是否與病毒傳播能力相關，進而引發流感疫情暴發，需要進一步研究。

由于流感病毒基因組分節段的特點，當不同亞型流感病毒共同感染宿主細胞時可發生基因重配[5]，這也是流感病毒不斷進化的重要方式之一，新重配的病毒常引起人間流感的大流行，在歷史上有3次流感大流行就是由重配流感病毒所引起[6-7]。2009年引起全球廣泛流行的pdm2009 H1N1(本研究中也稱“甲型H1N1”)即是由南美H1N1禽流感病毒的PB2、PA基因，人H3N2流感病毒的PB1基因、南美H1N1經典豬流感病毒的HA、NP、NS和歐亞類禽H1N1豬流感病毒的NA、M基因重配進化而來[8]。大量研究發現，pdm2009 H1N1流感病毒宿主范圍多樣，可以感染火雞[9]、犬[10]、貓[11-13]、野鳥[14]等，提示pdm2009 H1N1流感病毒有重配產生新型流感病毒的可能[15]。因此開展甲型H1N1流感病毒全基因組進化分析對新型重配病毒的發現有著重要意義。在本研究中所選取的9株2019年廣州市甲型H1N1流感病毒未發現不同基因來源的基因重配現象。2020年新型冠狀病毒在全球廣泛流行，我國及時啟動了全面且有效的防疫對策，在采取高風險地區封閉管理、學校和托幼機構休學、加強佩戴口罩和衛生消毒等一系列防疫措施后，我國的新冠病毒傳播得以有效控制，同時也控制了包括甲型H1N1流感病毒在內的呼吸道病原體的流行和傳播。2020年廣州市流感監測數據顯示，截止目前尚未監測到甲型H1N1流感病毒，但隨著復工復產、人流活動的增加，下一階段是否會發生甲型H1N1流感病毒流行，以及繼續2019年下半流行株持續流行，還是在此基礎上出現新變異株，需要持續監測。

利益沖突：無