單增李斯特菌質粒研究進展

毛 盼，葉長蕓

單增李斯特菌(L.monocytogenes, LM)是一種兼性厭氧的革蘭陽性食源性病原菌，可引起人或動物的流產、敗血癥、腦膜炎、腦膜腦炎等嚴重疾病。免疫力缺陷或低下的人群易感，致死率高達20%～30%[1]。單增李斯特菌以胞內寄生的方式引起動物和人類患李斯特菌病，亦以腐生方式存在于環境中，廣泛分布于土壤、農作物、污水、動物和食物環境。單增李斯特菌具有很強的抵抗多種不同應激壓力的能力，包括廣范圍的pH條件、不同溫度、高鹽、消毒劑等[2]。單增李斯特菌可形成生物膜持續定植于食品加工環境，易造成交叉污染而引起食源性感染暴發。單增李斯特菌具有高致病性、分布廣、耐受力強等特點，是威脅食品安全和引起公共衛生問題的重要病原菌之一。

單增李斯特菌具有強大的環境適應能力，單增李斯特菌質粒與其抗逆性有關。質粒是細菌染色體外具有遺傳功能的DNA，非細菌生長代謝的必需元件，在輔助宿主菌的生存和適應中發揮重要作用。質?？山閷Ъ毦g遺傳物質的轉移，使受體菌獲得供體菌的選擇性優勢，如抗逆性、毒力、耐藥等。上世紀80年代，Perez-Diaz等[3]首次報道了單增李斯特菌質粒，后來的研究發現質粒在單增李斯特菌中分布廣泛，并發揮一定的生物學功能。本文將對單增李斯特菌質粒的分類、分布以及生物學特性等研究進展進行概述。

1 單增李斯特菌質粒分類及分布

Kuenne等[4]對李斯特菌屬14個質?；蚪M進行比較分析，發現所有質粒為同一種復制子類型，屬于θ復制質粒pAMbeta1，提示這些質粒為同一祖先來源，該質粒復制子的宿主譜很廣，具有在屬內菌株間水平轉移的潛能。多項研究根據李斯特菌質粒repA基因，對質粒進行分類[3，7]。目前Hingston等[5]研究對單增李斯特菌質粒分類較為全面，分為G1和G2兩個組別，G2又分成兩個亞組。G1質粒(26～88 kbp)較小但攜帶更多的可移動元件(如前噬菌體、轉座子、插入序列)，G2質粒(55～107 kbp)較大，G2組的sub2亞組質粒均編碼毒力相關蛋白(如細胞表面蛋白、分泌蛋白E)。G2質粒的GC含量(36.6%～37.7%)稍高于G1質粒(34.4%～36.9%)。所有質粒均編碼RepA(質粒復制機制)、RepB(質粒分配機制)以及核酸外切酶(DNA修復機制)。同一單增李斯特菌菌株的不同基因片段中出現多個repA基因現象，提示存在多質粒的可能性，NCBI基因組數據中已發現在1株單增李斯特菌中存在5個質粒[5,8-9]。已有報道采用PCR方法擴增不同類型的復制子對大腸桿菌等細菌的質粒進行分型[10]，而關于單增李斯特菌質粒尚無統一的分型標準。

研究發現單增李斯特菌中質粒的攜帶率為28%～90%，大小為14～106 kbp[11]。相比臨床菌株，質粒在環境和食品源性的菌株中更為常見。食源性單增李斯特菌中持續性菌株的質粒分離率高達75%，而散發菌株的質粒分離率為35%[11]，提示質粒對宿主菌在環境中的生存能力和適應性具有一定輔助作用。部分型別的單增李斯特菌中攜帶同一高度保守質粒，如ST121型、ST204型[12-14]，ST8型單增李斯特菌的質粒分為兩個組別(n=10)，兩組質粒序列差異顯著，但每個組別內的質粒序列高度保守[15]。

早期研究單增李斯特菌質粒主要通過PCR擴增repA基因檢測質粒的存在。近年來隨著基因組測序技術的發展，質粒譜和比較基因組學研究取得重大進展。Naditz等[9]分析了32個國家近60年來的1 924株單增李斯特菌基因組，發現質?？偡蛛x率為53%，大小為3～140 kbp。這些質?；蚓哂懈叨缺Ｊ匦?，核苷酸同源性最低為91.9%。該研究發現ST121、ST5、ST3、ST8、ST204型菌株質粒攜帶率較高(>50%)，ST1和ST2型菌株質粒攜帶率較低(<15%)，ST4型菌株均不攜帶質粒。質粒攜帶率與菌株類型有關，部分質粒僅存在于特定型別的單增李斯特菌，如pLM6179僅在ST121型菌中檢測出[9,11-12]，而部分質粒分布廣泛，如質粒pLMG1-7、pLMG2-7存在于多個單增李斯特菌血清型菌株，并在多個國家分離菌株中存在，但具體功能不明[5]。

2 單增李斯特菌質粒的生物學功能

2.1質粒相關功能基因 已有研究發現單增李斯特菌質粒攜帶功能基因分別與重金屬抗性、消毒劑抗性、氧化應激抗性、熱抗性、鹽抗性、毒力、耐藥性等相關(表1)。 IV型分泌系統在質粒的結合轉移發揮了重要作用。毒素抗毒素系統編碼一種穩定的毒素及一種不穩定的抗毒素，為質粒解離后致死系統(PSK)，具有維持質粒穩定存在的功能。雖然維持質?；虻姆€定對宿主具有一定負擔，但其功能基因在特定條件下發揮作用有利于宿主菌的生存。

表1 單增李斯特菌質粒功能相關因子Tab.1 Plasmid-associated function factors in L. monocytogenes

2.2 環境壓力抵抗能力

2.2.1苯扎溴氨抗性 苯扎溴銨等季銨化合物消毒劑被廣泛應用于食品加工和醫療環境的消毒。長期頻繁地使用消毒劑導致抗性菌株的產生并在環境中定植，可通過交叉污染轉移至食品中或造成院內感染。關于單增李斯特菌質粒攜帶的bcrABC基因介導苯扎溴銨抗性的研究較多，Dutta V等[25]發現116株不同來源的單增李斯特菌中71株具有苯扎溴銨抗性，除了1株外均含bcrABC基因。Xu D等[16]發現攜帶bcrABC的質?？伤睫D移至大腸桿菌。Elhanafi等[26]在1998—1999年多地李斯特菌病的暴發菌株中均檢測出苯扎溴銨抗性相關的質粒pLMST6，消除該質粒后菌株的苯扎溴銨抗性減弱，野生株在苯扎溴銨刺激后外排泵EmrC及其TetR家族轉錄調控因子的mRNA和蛋白表達水平均顯著增高。

2.2.2重金屬抗性 單增李斯特菌廣泛分布于土壤、污水、動物和食品等環境中。環境中的重金屬污染廣泛，重金屬穩態對單增李斯特菌維持雙重腐生和寄生方式至關重要[27]。單增李斯特菌質粒常攜帶重金屬抗性(如鎘、銅、鋅、汞、砷抗性)，關于鎘抗性的研究較多。金屬鎘在農業和工業中的廣泛使用，如污水排放、垃圾焚燒和化肥施用，鎘污染出現在土壤、水和空氣中，并最終進入食物鏈。質粒的鎘耐受基因盒編碼P-ATP依賴的鎘外排泵(cadA)及其轉錄調控因子(cadC)。與染色體上的基因cadA4相比，質粒攜帶的抗性基因可產生更強的鎘抗性[5,28]。質粒編碼的CadA1和CadC1常位于Tn5422轉座子上，質粒攜帶鎘抗性基因率較高可能與此轉座子有關。部分質粒亦編碼CadA2、CadC2，如pLM80[16]。在質粒鎘抗性基因附近常攜帶其他金屬轉運體和多銅氧化酶(Mco)[29]。

2.2.3其他抗性 近年來，單增李斯特菌質粒與宿主菌抵御各種惡劣環境的關系備受關注。Naditz等[11]對持續性菌株的基因組特征分析發現，質粒p4KSM(ST5)、pLMR479a(ST8)、pLM6179(ST121)在特定ST型別菌株中分離率高，提示這些質?？赏ㄟ^提高宿主菌對高鹽、氧化應激等耐受性而利于宿主菌的生存。Zhang等[30]發現質粒pLMSZ08可促進宿主菌形成生物膜，該質粒消除后細菌的生物膜形成能力減弱，但質粒上生物膜形成相關的基因尚未明確。Pontinen等[20]發現質粒pLM58編碼的ClpL(熱休克蛋白 HSP100亞家族)可提高宿主的耐熱能力。Hingston等[5]發現Npx、Gbu前體、多金屬轉運ATP酶在單增李斯特菌質粒中較為多見，在6% NaCl和pH5.0條件下，質?；騨px、cadA1、mco、clpL的表達水平顯著增強，提示質粒的存在與抗酸和抗鹽有關。Npx 和Gbu前體相鄰存在，緊鄰3個假設蛋白和1個多金屬轉運ATP酶，移動轉座元件位于這整個區域的兩端，提示這些基因具有可轉移性和功能性。單增李斯特菌的環境適應能力極強，了解其在不良條件下的生存和持續存在機制對食品加工環境的污染控制至關重要。

2.3致病性 毒力相關質粒通常為大的(>40 kbp)低拷貝元件，編碼促進宿主-病原體相互作用的基因[31]。毒力相關質粒的作用也不容忽視，是腸桿菌科引起人類腹瀉的重要原因。Den Bakker等[32]首次報道單增李斯特菌潛在毒力相關質粒pLMIV上具有毒力相關的編碼基因inlA、inlB、inlC和prf。Rychli等[33]發現該質粒的21 kbp片段(內化素家族)也在澳大利亞單增李斯特菌病暴發菌株的染色體上存在。細菌可能在長期進化過程將有利的基因從質粒轉移到染色體上從而避免了維持質粒的成本[34]。Kropac等[19]運用斑馬魚胚胎模型證實質粒pLMST6可在一定程度提高宿主菌的毒力。G2組sub2亞組的質粒編碼多種毒力相關基因，但這些基因是否發揮功能及其機制尚不清楚[5]。

2.4耐藥性 目前全球的抗生素耐藥性危機主要與質粒介導的抗生素耐藥基因(antibiotic resistance genes，ARG)傳播有關[35-36]。關于中國單增李斯特菌質粒攜帶耐藥基因的報道較少。但亦有報道單增李斯特菌質粒pNH1的轉座子攜帶新型多重耐藥基因簇，使其對多種抗生素耐藥[22]。在食品、臨床樣本中檢出多重耐藥結合質粒pIP811、pLM78，其可在種內轉移及跨屬傳播[23-24,37]。通過組學分析發現單增李斯特菌多個質粒攜帶多藥外排泵EbrAB，具體功能尚未進一步研究，但在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中已證實此外排泵與溴化乙錠、丫啶黃抗性有關。有研究提示EbrAB多藥外排泵在細菌的毒力、膽汁抗性、消毒劑抗性中發揮一定的作用[38-39]。一些多藥外排泵，如單增李斯特菌外排泵ErmC[19]，通過分泌周期性di-AMP來觸發受感染的巨噬細胞產生Ⅰ型干擾素。單增李斯特菌耐藥率較低，但質?？勺鳛槭澄镦溕夏退幓虻膬π畛?，李斯特菌屬可通過來自腸球菌的質粒轉移獲得多重耐藥性[24]。耐藥基因的攜帶可使宿主菌對抗生素產生抗性，從而導致臨床抗生素治療無效，對微生物種群中質粒相關耐藥機制的研究有利于積極應對抗生素耐藥性的產生及流行。

2.5質?；虻乃絺鞑?基因可通過結合、轉化、轉導等水平傳播(HGT)方式在細菌間進行轉移?；蛩絺鞑ナ羌毦M化的重要驅動力，是細菌間傳遞抗性、毒力、耐藥性，并使細菌獲得新的生存特性的重要途徑。質粒在復制或結合轉移過程中可能發生基因序列的重排、刪除或插入，導致質粒大小及功能的改變。在質粒進化過程中，質粒的功能基因亦可轉移至染色體上，從而穩定的賦予宿主菌特定的功能。目前報道攜帶功能基因的單增李斯特菌質粒上IS插入序列、整合子較少，攜帶鎘抗性基因的轉座子Tn5422常見于單增李斯特菌質粒[40]。已有關于單增李斯特菌質粒結合轉移的報道，如耐藥質粒pLM78可轉移至鏈球菌、耐藥質粒pIP811可轉移至糞腸球菌[23]，以及苯扎溴銨抗性質粒pLMST6可在單增李斯特菌間轉移，并可能與致病性相關[19]。Ghigo等[41]研究發現結合質?？纱偈股锬さ男纬?，提示結合性質?？赡苁窃簝瘸掷m性感染的原因，同時增加了毒力因子在菌株間轉移的風險。攜帶環境相關抗性基因的結合性質粒有助于宿主菌的生存，并可在種群中傳播以維持宿主菌的持續存在，具有高毒力相關因子和多重耐藥因子的結合性質粒的菌株是引起臨床感染暴發的原因，因此具有重要的公共衛生意義。

3 展 望

質粒是微生物功能基因的儲蓄池和傳播者。目前對單增李斯特菌質粒的認識和研究中已明確功能的質?；虿⒉欢?，許多質粒編碼的假想蛋白基因還有待深入研究。有研究采用多種方法消除細菌中的質粒，可降低甚至消除細菌的耐藥性，使細菌恢復對抗生素的敏感性，降低抗菌藥物的用量，提高臨床療效，也是未來應對細菌耐藥的策略之一[42-43]。能否研發一種有效的質粒消除方法應用于食品加工環境中的細菌，以清除持續性交叉污染的菌株，同時減弱攜帶毒力相關質粒菌株的致病性。盡管對單增李斯特菌質粒分布狀況已有較全面的了解，但單增李斯特菌質粒的分類、功能和作用機制等仍有待進一步的研究。

利益沖突：無