CYP450 酶內源性生物標志物的研究進展*

莫錦靈，應玉雯，沈 葉，王敦建，孫魯寧**，王永慶**

1 南京醫科大學第一附屬醫院 臨床藥理研究室，南京 210029；2 南京醫科大學 藥學院，南京 210029

藥物的有效性和安全性與其在體內的吸收、分布、代謝和排泄有關，而細胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）酶參與80%～90%藥物的Ⅰ相代謝[1]。因此，希望通過檢測CYP450 酶活性，了解藥物的體內代謝過程，預測藥物療效和不良反應。CYP450 酶的活性受到多種因素的影響[2]，包括基因、性別、年齡、疾病等，不同個體間代謝酶的活性可能有較大差異，如CYP2C19 不同突變體會造成個體間的藥物代謝差異[3]，因此需要密切關注代謝酶的活性。外源性探針廣泛用于臨床試驗中CYP450 酶活性的測定[2]，這種方法需要受試者服用探針藥物（如檢測CYP3A 活性需口服咪達唑侖[4]），同時采集受試者血樣以測定血藥濃度。但以非治療為目的且需要頻繁地采血，在特殊人群（如小兒、孕婦、老人等）中應用存在著困難[5]。CYP450 酶參與機體內源性化合物的代謝，如膽固醇、脂肪酸等，部分內源性物質可作為測定CYP450 酶活性的生物標志物[2]。內源性內源性生物標志物用于評價CYP450酶活性不借助外源性探針藥物，利用某些內源性物質及其代謝物的水平變化來反映酶的變化，具有更好的依從性[4]。本文匯總了CYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和CYP3A 6 種重要CYP450 酶亞型內源性生物標志物的研究進展。

1 對主要CYP450 酶內源性生物標志物的分析

2.1 人體內的CYP450

藥物代謝發生在肝臟、小腸、腎等組織中，肝臟是代謝的主要器官，其微粒體酶活性最強。其中最重要的氧化酶因其在還原狀態下可與CO 結合，在波長450 nm 處有一最大吸收峰，故認為是細胞色素P450 酶[6]。位于肝臟內質網和線粒體內膜上的CYP450 是參與藥物Ⅰ相代謝的關鍵酶，經酶催化的氧化反應是藥物體內代謝的主要途徑。CYP450 參與了許多內源性物質如脂肪酸、花生四烯酸的代謝過程和外源性化合物如藥物、環境中污染物的處置過程[7]。

CYP450 酶是一個參與編碼500 多種酶蛋白的超家族[8]。其可按氨基酸的序列分類，同一家族的氨基酸序列有40%相似性，同一亞家族相似性超過55%[7]。在人肝微粒體中參與藥物代謝的CYP450 酶主要有CYP1A、CYP2C、CYP2D、CYP2E、CYP3A 五大類，它們占肝臟中CYP450 酶總含量＞75%。

1.2 CYP1A2 的內源性生物標志物

CYP1A2 約占CYP450 酶總量的13%，僅次于CYP3A 和CYP2C[9]。CYP1A2 參與咖啡因、硝苯地平、華法林、普萘洛爾等多種外源性藥物的代謝，也負責部分內源性激素的羥化反應，除此之外，CYP1A2 也參與一些前致癌物（黃曲霉毒素、亞硝胺等）在體內的活化過程[9]。測定CYP1A2 活性的外源性探針藥物主要是咖啡因[10]，內源性生物標志物主要有褪黑素（melatonin）及其6-羥基化代謝物（6-hydroxymelatonin）[4]。在體外肝微粒體模型研究中發現，褪黑素通過CYP1A1、CYP1A2 及CYP1B1 代謝生成6-羥基褪黑激素，其中CYP1A2 為肝內主要代謝酶[4]。Wang 和Hiemke 通過高效液相色譜結合電化學檢測法，發現褪黑素主要代謝為6-羥基化代謝物和N-乙酰羥色胺（N-acetylserotonin，NAS），添加CYP1A2的特異性抑制劑呋拉茶堿后，僅檢測到少量NAS，推測6-羥基代謝物是經CYP1A2 代謝[11]，理論上褪黑素及其6-羥基化代謝物可作為檢測CYP1A2 活性的內源性生物標志物。

目前檢測人體中褪黑素的方法有高效液相色譜法（HPLC）、高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS/MS）[12]和酶免疫檢測法（ELISA）[2]。有研究利用生物免疫法測定血清褪黑素的藥時曲線下面積（AUC）[4]，分別測定受試者吸煙（增加CYP1A2的活性）前后外源性和內源性血漿褪黑素水平變化，結果外源性血漿褪黑素水平在吸煙后顯著降低，而內源性血漿褪黑素水平未受到顯著影響?，F有研究將外源性褪黑素作為CYP1A2 探針，但因其缺乏相關理論，還存在爭議。研究[4]表明，咖啡因的清除率與內源性血清褪黑素AUC 值不存在顯著的相關性，而在人體內咖啡因清除率的90%以上由CYP1A2 介導[13]，產生這些結果的原因可能是內源性褪黑素的含量不僅與CYP1A2 代謝有關，還與褪黑素的重新分泌有關，褪黑素的分泌作用掩蓋了它的含量變化。因此，使用內源性褪黑素作為CYP1A2 的探針，應選擇合適的指標，如排除褪黑素分泌晝夜節律的影響[2]。

1.3 CYP2A6 酶的內源性生物標志物

CYP2A6 廣泛參與藥物的代謝，如依非韋倫、來曲唑等，同時也能將許多致癌前體化合物代謝為強致癌物，如將煙草中大量的亞硝胺致癌前體化合物代謝為亞硝基亞甲胺[14]。CYP2A6 的外源性探針主要是香豆素[15]。吸煙者體內含有尼古丁，尼古丁經CYP2A6 的代謝產物可替寧（cotinine，COT）和反式-3'-羥基可替寧（trans-3'-hydroxycotinine，3HC）可作為表征CYP2A6 酶活性的內源性標志物。

以內源性生物標志物評價酶活性的方法有COT/尼古丁和3HC/COT 的比值（C3HC/CCOT）。由于尼古丁的半衰期（2 h）比COT 的半衰期（16 h）低得多[16]，若考慮使用COT/尼古丁的比值評價CYP2A6 的活性，CYP2A6 活性結果取決于最后一次接觸尼古丁的時間，需要提前較長時間禁止受試者接觸尼古丁，使體內COT 被完全代謝；若使用C3HC/CCOT評價CYP2A6的活性，3HC 由COT 產生，半衰期較短（6 h），C3HC/CCOT與COT的半衰期相關，與COT/尼古丁的比值相比，以C3HC/CCOT作為內源性生物標志物評價更加穩定。Dempsey D 等[17]研究表明，唾液和血漿中C3HC/CCOT與尼古丁口服清除率有顯著的相關性，而尼古丁代謝的主要指標是尼古丁的口服清除率，表明C3HC/CCOT與尼古丁的代謝有高度相關性，進而證實C3HC/CCOT是表征吸煙者CYP2A6 活性的可靠內源性生物標志物。測定3HC 和COT 濃度的主要方法為GC-MS 和HPLC-MS/MS[17]。

以C3HC/CCOT評價CYP2A6 活性的方法在臨床上已有了應用，如Lerman C 等[18]通過測定C3HC/CCOT預測了尼古丁經皮治療戒煙的有效性，在C3HC/CCOT低的患者中有46%的人戒煙成功，而在比值高的患者中僅有28%的人戒煙成功，C3HC/CCOT與戒煙效果有顯著的相關性，CYP2A6 快代謝患者比慢代謝患者的戒煙效果較差，表明C3HC/CCOT對預測尼古丁經皮治療的戒煙成功率有著重要臨床意義。

1.4 CYP2C19 酶的內源性生物標志物

經CYP2C19 代謝的藥物占CYP450 酶代謝的2%，臨床上參與代謝有許多重要藥物，如奧美拉唑、氯匹格雷等[4]。CYP2C19 的外源性探針主要有奧美拉唑、美芬妥英[10]，內源性生物標志物還在研究中，研究方向主要是花生四烯酸（AA）。

花生四烯酸可被所有CYP450 酶代謝，但經CYP2C19代謝的代謝率最高，生成4 種環氧三烯酸（epoxyeicosatrienoic acids，EETs）和11 種羥基花生四烯酸（hydroxyeicosatetraenoic acids，HETEs）[19]。研究認為，EETs 可代謝生成碳三烯酸（dihydroxyeicosatrienoic acids，DHETs），其 中11，12-DHET 和14，15-DHET 是EET 占比最大的代謝產物。為證明CYP2C19 活性與EET 水平呈正相關[20]，Akasaka T 等[21]測定了不同CYP2C19 活性的血清樣本中11，12-和14，15-DHETs 的濃度，用來替代EET 水平，發現CYP2C19慢代謝受試者的血清11，12-和14，15-DHETs 水平顯著低于快代謝受試者，檢測DHET 的方法主要有酶聯免疫法[21]。

但DHET 并非EETs 經CYP2C19 代謝的直接產物，是EET經可溶性環氧化物水解酶生成的代謝產物[20]，其濃度受到該水解酶影響，故無法利用血清11，12-和14，15-DHETs 水平代替EET 水平評價CYP2C19 的活性。未來需要直接研究AA 的代謝產物EETs、HETE 的水平與CYP2C19 活性的關系，以驗證AA 是評價CYP2C19 活性的內源性生物標志物。

1.5 CYP2D6 酶的內源性生物標志物

CYP2D6 存在于肝臟、心臟和腦組織中，參與約25%藥物的代謝，如阿片類藥、抗精神病藥、抗抑郁藥等[22]。CYP2D6 的外源性探針有右美沙芬[22]，內源性生物標志物有5-甲氧基色胺（5-methoxytryptamine，5-MT）/5-羥色胺（serotonin，5-HT）和松香烴（pinoline，PIN）/6-羥基-1，2，3，4-四氫化-β-咔啉（6-hydroxy-1，2，3，4-tetrahydro-beta-carboline，6-OHTHBC）。

5-MT 是一種微量的內源性吲哚胺類，Yu AM 等[23]發現5-HT 是唯一經CYP2D6 介導的5-MT 的代謝物。之后Kirchheiner J 等[24]測定了經不同活性CYP2D6 代謝后血小板中5-HT 的濃度，結果顯示，CYP2D6 活性高的受試者體內5-HT 的含量顯著高于CYP2D6 活性低的受試者，提示5-MT/5-HT 可能是測定CYP2D6 活性的內源性生物標志物。但5-HT 的半衰期較長（大于3 天）[4]，可能會因代謝不及時而不能準確反映CYP2D6 的活性，研究發現，受試者服用CYP2D6 抑制劑24 h 后體內5-HT 含量無明顯變化[24]。因此，需要進一步的臨床研究來驗證5-MT/5-HT 能否作為內源性生物標志物、以反映CYP2D6 的活性[4]。

PIN 是一種存在于哺乳動物大腦和組織中的內源性化合物[24]，經CYP2D6 特異性地發生O-去甲基化代謝為6-OH-THBC。Jiang XL 等[25]發現，在人肝微粒體 中，加入8 種代謝酶抑制劑后，只有奎尼?。–YP2D6 抑制劑）對PIN 的O-去甲基化反應有明顯的抑制作用，并在注射PIN 后，野生型小鼠體內的PIN/6-OH-THBC 值（0.29±0.19，n=4）顯著高于CYP2D6 轉基因小鼠（0.0070±0.0048，n=4）?；诖搜芯?，PIN/6-OH-THBC 被認為可能是反映CYP2D6 活性的內源性生物標志物[4]。

目前，通過測定尿液中的C6-OH-THBC/CPIN比值評價人體內CYP2D6 的活性[26，27]。如米氮平為經CYP2D6 代謝的抗抑郁藥物，高達40%的患者存在耐藥現象，Sychev DA 等[26]利用口服米氮平患者尿液中C6-OH-THBC/CPIN比值反映CYP2D6 活性，CYP2D6 活性高的患者米氮平代謝加快，藥效降低，提示可以根據C6-OH-THBC/CPIN比值來指導臨床用藥，減小耐藥性的發生。但以上研究未將C6-OH-THBC/CPIN比值與特異性探針藥物的代謝結果進行比較[4]，因此以C6-OH-THBC/CPIN比值作為內源性指標還需要進一步研究確認。

1.6 CYP2E1 酶的內源性生物標志物

CYP2E1 參與約90 種外源性藥物以及各種內源性脂肪酸的代謝，包括月桂酸、硬脂酸、花生四烯酸等，也能代謝體內多種有毒底物，如乙醇、四氯化碳等[28]。測定CYP2E1 活性的典型外源性探針藥物為氯唑沙宗[28]、月桂酸（lauric acid，LA）及其（ω-1）-羥基化產物11-羥基月桂酸（11-hydroxylauric acid，11-OH-LA），均是測定CYP2E1 活性的內源性生物標志物。

Amet Y 等[29]發現，經CYP2E1 誘導劑（吡啶、丙酮、異煙肼等）處理的鼠肝微粒體產生更多的11-OH-LA。Choi YJ 等[30]考察了人肝微粒體中14 種CYP 重組酶對LA 代謝反應的影響，發現經CYP2E1 代謝的11-OH-LA 生成率最高。同時，氯唑沙宗發生6-羥基化反應生成6-羥基化氯唑沙宗，而LA的（ω-1）-羥基化反應和氯唑沙宗的6-羥基化反應具有顯著的相關性[30]。綜上，LA/11-OH-LA 可能是測定人或鼠肝微粒體中CYP2E1 活性的內源性生物標志物。目前研究建立HPLC法和HPLC-MS/MS 法[30]測定了人肝微粒體中LA 和11-OHLA 濃度，并研究了LA/11-OH-LA 與CYP2E1 活性的關系。然而，僅在人肝微粒體進行了部分研究，仍需進一步的臨床研究驗證LA/11-OH-LA 能否用于測定人體CYP2E1 的活性。

1.7 CYP3A 酶的內源性生物標志物

CYP3A 是肝臟中最重要的代謝酶之一，在肝臟和小腸中表達最為豐富，約占肝臟總CYP 含量的30%，參與約50%上市藥物的代謝[31]。CYP3A 常用的外源性探針藥物主要是咪達唑侖[10]，且對測定CYP3A 活性的內源性生物標志物也研究眾多，其中常用的兩種內源性標志物有：氫化可的松（cortisol）及其代謝物6β-氫化可的松（6β-hydroxycortisol，6β-OHF）和膽固醇（cholesterol）及其代謝物4β-羥基膽固醇（4βhydroxycholesterol，4β-OHC）[4]。

Shibasaki H 等[32]發現，患者服用利福平（CYP3A 誘導劑）后，人肝微粒體中氫化可的松發生6-羥基化的活性更高。而用酮康唑（CYP3A 抑制劑）處理人肝微粒體后，氫化可的松濃度顯著升高[33]。Furuta T 等[34]比較了CYP3A、CYP2B6 和CYP2C9 幾種CYP450 亞型對氫化可的松反應的影響，結果證實，氫化可的松主要經CYP3A 發生6β-羥基化反應?；谝陨涎芯?，認為6β-羥基皮質醇是測定CYP3A 活性的內源性生物標志物[4]。6β-羥基皮質醇/皮質醇比值與皮質醇清除率可用于評價CYP3A 的活性[4，35，36]。目前，CYP3A 活性評價的標準是咪達唑侖的清除率，研究表明[35]，皮質醇清除率與咪達唑侖腎清除率有顯著的相關性，但有文獻發現[36]，尿液6β-羥基皮質醇/皮質醇比值與咪達唑侖清除率無顯著相關性。因此，認為皮質醇清除率比6β-羥基皮質醇/皮質醇比值評價CYP3A 的活性更加準確。測定血漿和尿液中6β-羥基皮質醇和皮質醇濃度的分析方法包括ELISA、HPLC 法[34]和HPLCMS/MS 法[37]。

4β-羥基膽固醇是膽固醇經CYP3A 代謝的內源性化合物，不受腎排泄功能和體內膽固醇水平的影響[36]。血漿4β-羥基膽固醇濃度以及4β-羥基膽固醇/膽固醇與咪達唑侖血漿清除率有一定的相關性[36]。然而，4β-羥基膽固醇的半衰期約為17 天，要準確地檢測4β-羥基膽固醇的濃度，至少需要等到2 周以后，使濃度達穩態[38]。測定血漿中4β-羥基膽固醇和膽固醇濃度的分析方法有GC-MS/MS 法和HPLC-MS/MS 法[39，40]。

2 討論

2.1 內源性生物標志物研究進展

CYP450 各亞型內源性生物標志物見表1。綜上所述，CYP1A2、CYP2A6、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1 和CYP3A 主要的內源性標志物分別為褪黑素/6-羥基褪黑素、3HC/COT、AA/EET 和AA/19-HETE、5-MT/5-HT 和PIN/6-HO-THBC、LA/11-OH-LA、6β-羥基皮質醇/皮質醇和4β-羥基膽固醇/膽固醇。檢測方法匯總見表2。

內源性生物標志物的相關進展主要體現在以下幾個方面：（1）在某些研究選取的評價代謝酶活性的方法中，待評價的代謝酶不是該評價指標的主要影響因素，無法有效地評價酶活性，如CYP2C19 酶活性的評價指標11，12-和14，15-DHETs 水平不僅與CYP2C19 酶活性有關，同時與環氧化物水解酶有關[23]，未來需要選取更合適的評價方法進行研究，證明內源性生物標志物的可靠性。（2）有些代謝酶的內源性生物標志物經過一定的臨床研究后存在一些問題，如某些代謝產物（如5-HT 和4β-羥基膽固醇）半衰期過長，難以評價酶的快速變化，某些評價酶活性的方法與外源性探針代謝結果無顯著相關性（如R6β-羥基皮質醇/皮質醇），提示需選擇更可靠的內源性生物標志物或評價方法。（3）某些內源性生物標志物已通過臨床研究證明其評價代謝酶活性的可行性（如3HC/COT 和皮質醇清除率），但這些內源性生物標志物如何更好地用于臨床評價還需要深入研究。

表1 CYP450 酶各亞型內源性生物標志物的評價方法匯總

2.2 酶活性評價及臨床應用

評價酶活性的方法主要有內源性代謝底物濃度、內源性代謝產物濃度，以及內源性代謝產物/代謝底物的比值。應用較為廣泛的是內源性代謝產物的濃度和內源性代謝產物/代謝底物的比值，而內源性代謝底物的濃度較少用于酶活性的評價，可能是由于內源性底物的濃度受到多種因素的影響，包括代謝酶代謝和底物的重新分泌等，導致結果不可靠。

在臨床研究中需要注意：（1）應選擇半衰期合適的內源性生物標志物濃度。若半衰期過長，需要待體內底物代謝完全后再采集生物樣本，對受試者要求較高，若半衰期過短，代謝產物可能在采集之前已被代謝，需要嚴格控制采樣時間。（2）應選擇合適的生物樣本。目前用于臨床研究的有唾液、血漿和尿液，各個樣本有其各自優缺點。體內大多數物質經尿液排泄，濃度較高，容易采集，但可能存在代謝途徑差異、個體間的腎臟清除率差異等問題，使結果不準確[41]。血漿中內源性生物標志物的濃度更為穩定，但某些物質可能由于代謝較快而濃度過低，對檢測要求更高，且采集過程需要抽血，受試者依從性較差。因此，可根據試驗目的，選擇快速、簡便、準確的方法，測定各CYP450 酶活性的生物樣本。（3）內源性探針的濃度存在個體間差異，建議臨床研究時采集并測定基線值，以消除個體差異對CYP450 酶活性評價的影響。

3 小 結

內源性探針用于評價CYP450 酶活性不借助外源性探針藥物，利用某些內源性物質及其代謝物的水平變化來反映酶的變化，具有更好的依從性[4]。本文匯總了這6 種重要CYP450 酶亞型內源性生物標志物的研究進展。目前，能用于準確評價CYP450 酶活性的標志物還不多，個體差異、半衰期等問題還需要進一步的探討。期待今后會有更多的臨床研究，發現更為合適的內源性探針和評價方法。

表2 CYP450 酶各亞型內源性生物標志物檢測的HPLC-MS/MS 法匯總