白背飛虱若蟲和雄雌成蟲唾液腺蛋白鑒定

李 飛, 易金玉, 劉玉娣, 侯茂林

(中國農業科學院植物保護研究所, 植物病蟲害生物學國家重點實驗室, 北京100193)

白背飛虱Sogatellafurcifera是我國最重要的水稻刺吸式害蟲之一，若蟲與成蟲不僅通過口針刺吸稻株韌皮部汁液為害，還能傳播多種病毒病，對我國水稻種植產生了嚴重的危害(沈君輝等, 2003)。刺吸式昆蟲在漫長的進化過程中形成了有利于取食的口針結構，下顎特化成細長的口針，下唇延長形成喙(劉勇等, 2011)。刺吸式口器昆蟲的唾液可起幫助昆蟲取食、抑制植物防御反應、潤滑和保護口針等作用(Sharmaetal., 2014)。

唾液腺是昆蟲產生唾液大分子物質尤其是唾液蛋白的重要器官，黃海劍(2017)對灰飛虱Laodelphaxstriatellus、褐飛虱Nilaparvatalugens及白背飛虱3種飛虱唾液腺高表達基因進行分析發現飛虱唾液腺大量合成分泌蛋白，而這些蛋白很可能參與昆蟲-植物之間的互作。Su等(2012)用高通量測序技術獲得B型煙粉虱Bemisiatabaci唾液腺的轉錄組，分析得到了與分泌和傳毒有關的基因。褐飛虱唾液腺所分泌的唾液蛋白NI1860能夠影響褐飛虱的取食行為，在褐飛虱的致害性變異中發揮著重要作用(紀銳, 2013)。有研究顯示蚜蟲唾液腺存在與大麥黃矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus)傳遞相關的蛋白(王錫鋒和周廣和, 2003)。豌豆蚜Acyrthosiphonpisum唾液腺含分泌蛋白Armet和ACE，二者是具有調控作用的效應分子，在昆蟲與植物的相互作用中起重要的作用(王煒, 2014)。馬琳(2015)對角倍蚜Schlechtendaliachinensis唾液腺蛋白通過蛋白質組學方法進行檢測與鑒定，發現唾液腺中有4類特異性蛋白與致癭相關。鄧瑤等(2018)對白背飛虱唾液腺轉錄組測序發現，感染南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-stripeddwarfvirus)的白背飛虱有89個基因的表達發生了上調或下調的變化。白背飛虱唾液腺組織分泌唾液通過刺吸水稻造成危害，唾液腺蛋白與其取食為害和傳毒息息相關。

本研究通過液相色譜串聯質譜對白背飛虱唾液腺蛋白進行鑒定，與Unigene的蛋白數據庫進行比對，再通過KOG(Eukaryotic Orthologous Groups of Proteins)分析，KOG可對真核細胞蛋白進行完整全面地分類，與GO和KEGG比較，KOG數據庫提供的蛋白類別更多(Nieetal., 2015)。利用KOG數據庫(http: ∥www.ncbi.nlm.nih.gov/KOG)將鑒定的唾液腺組織蛋白分為信息存儲和處理(information storage and processing)、細胞過程和信號傳導(cellular processes and signaling)、新陳代謝(metabolism)以及表征欠佳(poorly characterized)4類進行蛋白功能分類，在此4大類下又分25個小類，再從25個小類中具體對比到某一個或類相關蛋白名稱。本研究將白背飛虱若蟲、雄成蟲和雌成蟲的唾液腺蛋白分別進行鑒定和KOG功能分類，對比分析不同發育階段和不同性別的白背飛虱唾液腺蛋白，從而為其防治提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試蟲飼養

實驗所用初始白背飛虱種群采自農業部桂林作物有害生物科學觀測實驗站，用TN1水稻置于培養箱中飼養，飼養條件：溫度27±1℃，相對濕度75%±5%，光周期16L∶8D。所用試蟲已在人工氣候箱內連續飼養10代以上。

1.2 試蟲唾液腺蛋白提取

將白背飛虱若蟲和雌雄成蟲在冰上麻醉，無菌培養皿上解剖分離出唾液腺組織，收集各約400頭作為試驗樣本，提取唾液腺組織，將收集的組織樣本置于離心管中，加入蛋白酶抑制劑Cocktail，進行離心，取上清溶液，向沉淀中加入500 μL裂解液，冰上超聲2 min，4℃旋轉裂解30 min，再4℃離心取上清溶液，將兩次上清溶液加入超濾管中，進行超濾至液體剩余0.1 mL左右，得到樣品蛋白。取出20 μL樣品上樣，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，染色。

1.3 唾液腺樣品蛋白還原烷基化和酶解

各取1.2節蛋白樣品25 μL，用裂解液補充體積到50 μL，加入終濃度20 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)在37℃下反應60 min；加入終濃度40 mmol/L碘乙酰胺(iodoacetamide)室溫下避光反應40 min；每管各加入預冷的丙酮(丙酮∶樣品=6∶1, v/v)，-20℃沉淀2 h；10 000 g離心20 min，取沉淀；用50 μL 100 mmol/L四乙基溴化銨(TEAB)充分溶解樣品；按照質量比1∶25(酶∶蛋白)加入胰蛋白酶(trypsin)在37℃酶解過夜。

1.4 肽段的液相色譜串聯質譜分析

將酶解的肽段復溶，用Sep-Pak進行肽段脫鹽，真空濃縮儀抽干；用質譜上樣緩沖液溶解，通過串聯質譜儀(Thermofishier Scientific)進行質譜分析。色譜分離時間為180 min，緩沖液A： 2% ACN(含0.1%甲酸)，緩沖液B：80% ACN(含0.1%甲酸)，流速為300 nL/min，MS掃描范圍(m/z)350～1 300，采集模式DDA，機器設置一級質譜分辨率70 000(質荷比/半峰寬)，碎裂方式HCD，二級分辨率17 500，動態排除時間30 s。

1.5 唾液腺蛋白鑒定及KOG功能注釋

對質譜原始數據進行峰識別，得到峰列表，建立Unigene.blast.pep.fasta數據庫，利用Proteome DiscovererTMSoftware 2.1軟件將質譜鑒定到的蛋白比對到Unigene.blast.pep.fasta數據庫，查庫時將Raw文件提交至Proteome Discoverer服務器，選擇已經建立好的數據庫，然后進行數據庫搜索。Proteome Discoverer服務器中Precursor Mass Tolerance設置為10 ppm，Fragment Mass Tolerance設置為0.05 Da，結果過濾參數為Peptide FDR≤0.01。

COG(Cluster of Orthologous Groups of Proteins)由NCBI創建并維護的蛋白數據庫，根據細菌、藻類和真核生物完整基因組的編碼蛋白系統進化關系分類構建而成。通過blast比對String數據庫，可以將某個蛋白序列注釋到某一個COG中，每一簇COG由直系同源序列構成，從而可以推測該序列的功能。COG分為原核生物和真核生物，真核生物的稱為KOG數據庫。根據UniProt數據庫中ID mapping將本次鑒定到的蛋白UniProt編號獲得相應KOG編號，然后根據KOG數據庫進行蛋白質功能注釋。

2 結果

2.1 白背飛虱唾液腺蛋白鑒定

通過液相色譜串聯質譜對白背飛虱唾液腺蛋白進行鑒定，與Unigene的蛋白數據庫進行比對，鑒定出白背飛虱若蟲樣本的唾液腺肽段數量為10 024個，蛋白數量為2 599個；白背飛虱雄成蟲樣本的唾液腺肽段數量為8 195個，蛋白數量為2 331個；白背飛虱雌成蟲樣本的唾液腺肽段數量為5 597個，蛋白數量為1 898個。其中，白背飛虱若蟲特有的唾液腺蛋白數量為385個，白背飛虱雄成蟲特有的唾液腺蛋白數量為168個，白背飛虱雌成蟲特有的唾液腺蛋白數量為82個；白背飛虱若蟲與雄成蟲含有相同唾液腺蛋白數量為319個，白背飛虱若蟲與雌成蟲含有相同唾液腺蛋白數量為60個，白背飛虱雄成蟲與雌成蟲含有相同唾液腺蛋白數量為60個。白背飛虱不同發育階段與不同性別的唾液腺蛋白具有一定的差異。

對白背飛虱唾液腺蛋白進行SDS-PAGE電泳，結果顯示大部分蛋白分子量分布在30～120 kD(圖1)。

圖1白背飛虱唾液腺蛋白SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE of salivary gland proteinsof Sogatella furciferaM: 預染的蛋白質分子量標準Pre-stained protein ladder; 1: 雄成蟲Male adult; 2: 雌成蟲Female adult; 3: 若蟲Nymph.

2.2 若蟲、雄成蟲和雌成蟲兩兩之間共有蛋白的KOG功能注釋

2.2.1若蟲和雄成蟲共有唾液腺蛋白的KOG功能注釋：根據鑒定到的蛋白UniProt編號獲得相應KOG編號，然后對比KOG數據庫進行蛋白功能注釋，KOG功能注釋將蛋白分為4大類——信息存儲與處理、細胞過程與信號傳導、新陳代謝以及表征欠佳，4大類又細分為25個小類。白背飛虱若蟲和雄成蟲共有唾液腺蛋白KOG功能注釋分析結果顯示，在319個蛋白中對比到162個具有KOG注釋蛋白，其中參與信息存儲與處理的蛋白數量為27個、參與細胞過程和信號傳導的蛋白數量為70個、參與新陳代謝的蛋白數量為38個，另有31個蛋白表征欠佳(圖2)。在25個小類中蛋白數量排在前三的是翻譯后修飾、蛋白質更新、伴侶蛋白(KOG類別為O)，信號轉導機制(KOG類別為T)，細胞內運輸、分泌和囊泡運輸(KOG類別為U)。白背飛虱若蟲和雄成蟲共有的唾液腺蛋白在信號轉導機制方面表現較為活躍。

圖2 白背飛虱若蟲和雄成蟲共有唾液腺蛋白KOG功能注釋Fig. 2 KOG functional annotation of salivary gland proteins shared by nymphs and male adults of Sogatella furciferaA: RNA加工與修飾RNA processing and modification; B: 染色質結構與動力學Chromatin structure and dynamics; J: 翻譯、核糖體結構和生物發生Translation, ribosomal structure and biogenesis; K: 轉錄Transcription; L: 復制、重組和修復Replication, recombination and repair; D: 細胞周期控制、細胞分裂、染色體分割Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; M: 細胞壁/膜/包膜生物起源Cell wall/membrane/envelope biogenesis; O: 翻譯后修飾、蛋白質更新、伴侶蛋白Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; T: 信號轉導機制Signal transduction mechanisms; U: 細胞內運輸、分泌和囊泡運輸Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; Y: 核結構Nuclear structure; Z: 細胞骨架Cytoskeleton; C: 能源生產和轉換Energy production and conversion; E: 氨基酸運輸和代謝Amino acid transport and metabolism; F: 核苷酸運輸和代謝Nucleotide transport and metabolism; G: 碳水化合物運輸和代謝Carbohydrate transport and metabolism; H: 輔酶運輸和代謝Coenzyme transport and metabolism; I: 脂質運輸和代謝Lipid transport and metabolism; P: 無機離子轉運和代謝Inorganic ion transport and metabolism; Q: 次生代謝產物生物合成、運輸和分解代謝Secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; R: 僅一般功能預測General function prediction only; S: 功能未知Function unknown.

2.2.2若蟲和雌成蟲共有唾液腺蛋白的KOG功能注釋：對白背飛虱若蟲和雌成蟲共有唾液腺蛋白進行KOG功能注釋分析，在60個蛋白中對比到33個具有KOG注釋蛋白。其中參與信息存儲與處理的蛋白數量為5個、參與細胞過程和信號傳導的蛋白數量為19個、參與新陳代謝的蛋白數量為3個，另有6個蛋白表征欠佳(圖3)。在25個小類中蛋白質數量排在前三的是信號轉導機制(KOG類別為T)，翻譯后修飾、蛋白質更新、伴侶蛋白(KOG類別為O)，細胞內運輸、分泌和囊泡運輸(KOG類別為U)。白背飛虱若蟲和雌成蟲共有的唾液腺蛋白在信號轉導機制方面表現較為活躍。

圖3 白背飛虱若蟲和雌成蟲共有唾液腺蛋白KOG功能注釋Fig. 3 KOG functional annotation of salivary gland proteins shared by nymphs and female adults of Sogatella furciferaA: RNA加工與修飾RNA processing and modification; B: 染色質結構與動力學Chromatin structure and dynamics; J: 翻譯、核糖體結構和生物發生Translation, ribosomal structure and biogenesis; O: 翻譯后修飾、蛋白質更新、伴侶蛋白Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; T: 信號轉導機制Signal transduction mechanisms; U: 細胞內運輸、分泌和囊泡運輸Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; Y: 核結構Nuclear structure; Z: 細胞骨架Cytoskeleton; C: 能源生產和轉換Energy production and conversion; E: 氨基酸運輸和代謝Amino acid transport and metabolism; G: 碳水化合物運輸和代謝Carbohydrate transport and metabolism; I: 脂質運輸和代謝Lipid transport and metabolism; R: 僅一般功能預測General function prediction only; S: 功能未知Function unknown.

2.2.3雄成蟲和雌成蟲共有唾液蛋白的KOG功能注釋：對白背飛虱若蟲和雄成蟲共有唾液腺蛋白進行KOG功能注釋分析，在60個蛋白中對比到21個具有KOG注釋蛋白質。其中參與信息存儲與處理的蛋白數量為3個、參與細胞過程和信號傳導的蛋白數量為12個、參與新陳代謝的蛋白數量為3個，另有3個蛋白表征欠佳(圖4)。白背飛虱雄雌成蟲共有唾液腺蛋白在信號轉導機制方面表現較為活躍。

圖4 白背飛虱雄成蟲和雌成蟲共有唾液腺蛋白KOG功能注釋Fig. 4 KOG functional annotation of salivary gland proteins shared by male and female adults of Sogatella furciferaA: RNA加工與修飾RNA processing and modification; J: 翻譯、核糖體結構和生物發生Translation, ribosomal structure and biogenesis; M: 細胞壁/膜/包膜生物起源Cell wall/membrane/envelope biogenesis; O: 翻譯后修飾、蛋白質更新、伴侶蛋白Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; T: 信號轉導機制Signal transduction mechanisms; U: 細胞內運輸、分泌和囊泡運輸Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V: 防御機制Defense mechanisms; W: 細胞外結構Extracellular structures; Z: 細胞骨架Cytoskeleton; F: 核苷酸運輸和代謝Nucleotide transport and metabolism; G: 碳水化合物運輸和代謝Carbohydrate transport and metabolism; I: 脂質運輸和代謝Lipid transport and metabolism; R: 僅一般功能預測General function prediction only; S: 功能未知Function unknown.

2.3 白背飛虱若蟲、雄成蟲和雌成蟲特有唾液腺蛋白KOG功能注釋

2.3.1白背飛虱若蟲特有唾液腺蛋白KOG功能注釋：在385個白背飛虱若蟲唾液腺特有蛋白中比對到181個具有KOG功能注釋的蛋白，其中參與信息存儲與處理的蛋白數量為37個、參與細胞過程和信號傳導的蛋白數量為81個、參與新陳代謝的蛋白數量為39個，另有35個蛋白表征欠佳(表1)。在25個小類中蛋白數量排在前三的是翻譯后修飾、蛋白質更新、伴侶蛋白(KOG類別為O)，信號轉導機制(KOG類別為T)，細胞內運輸、分泌和囊泡運輸(KOG類別為U)。白背飛虱若蟲特有唾液腺蛋白在信號轉導機制方面表現較為活躍。

2.3.2白背飛虱雄成蟲特有唾液腺蛋白KOG功能注釋：在168個白背飛虱雄成蟲唾液腺特有蛋白中比對到64個具有KOG功能注釋的蛋白，其中參與信息存儲與處理的蛋白數量為15個，參與細胞過程和信號傳導的蛋白數量為22個，參與新陳代謝的蛋白數量為13個，另有15個蛋白表征欠佳。雄成蟲特有唾液腺蛋白參與細胞過程和信號傳導中信號轉導機制(KOG類別為T)的數量最多，鑒定到有磷脂酰肌醇4-激酶、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶調節亞基、鈣離子端依賴激活蛋白、G蛋白亞基、ADP核糖基化因子相關蛋白、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、蛋白質磷酸酶2C/丙酮酸脫氫酶(脂酰胺)磷酸酶、絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白磷酸酶PP1催化亞基(表2)。白背飛虱雄成蟲特有唾液腺蛋白在信號轉導機制方面表現較為活躍。

2.3.3白背飛虱雌成蟲特有唾液腺蛋白KOG功能注釋：在82個白背飛虱雌成蟲唾液腺特有蛋白中比對到24個具有KOG功能注釋的蛋白，其中參與信息存儲與處理的蛋白數量為4個，參與細胞過程和信號傳導的蛋白數量為13個，參與新陳代謝的蛋白數量為4個，另有4個蛋白表征欠佳。雌成蟲特有唾液腺蛋白參與細胞過程和信號傳導中信號轉導機制(KOG類別為T)，翻譯后修飾、蛋白質更新、伴侶蛋白(KOG類別為O)，細胞內運輸、分泌和囊泡運輸(KOG類別為U)的數量排在前三，其次是新陳代謝機制和信息存儲和處理機制(表3)。白背飛虱雌成蟲特有唾液腺蛋白在信號轉導機制方面表現較為活躍。

3 討論

白背飛虱在取食過程中唾液腺會產生和分泌兩種唾液：一種是膠狀唾液，形成唾液鞘，保護口針避免機械損傷和化學攻擊；另一種是水狀唾液，在昆蟲刺穿植物組織時分泌，潤滑口針和傳導酶液(Sharmaetal., 2014)。白背飛虱從若蟲期到成蟲期均以刺吸水稻韌皮部汁液的方式取食為害。

本研究通過液相色譜串聯質譜技術對白背飛虱唾液腺蛋白進行鑒定，與Unigene的蛋白數據庫進行比對，對鑒定的蛋白進行分類整理，歸納出白背飛虱若蟲、雄成蟲、雌成蟲特有的唾液腺蛋白，以及若蟲與雄成蟲、若蟲與雌成蟲、雄成蟲與雌成蟲兩兩共有的唾液腺蛋白。KOG功能分類顯示6個蛋白類別下，唾液腺蛋白參與細胞過程和信號傳導功能表現最為活躍，蛋白數量占比最多，在這一類別下蛋白質主要參與翻譯后修飾、蛋白質更新、伴侶蛋白(KOG類別為O)，信號轉導機制(KOG類別為T)，細胞內運輸、分泌和囊泡運輸(KOG類別為U)(圖2-4)。KOG功能注釋可對真核細胞蛋白進行完整全面的分類，與GO注釋和KEGG注釋比較，KOG數據庫提供的蛋白類別更多(Nieetal., 2015)。本研究將鑒定到的蛋白UniProt編號獲得相應KOG編號，然后對比KOG數據庫進行蛋白質功能注釋。若無匹配結果，這可能與序列片段過短和缺乏注釋信息有關(魏利斌等, 2012)。信號轉導是指在遇到外源性信號時及時改變各種分子活性，改變細胞功能，使機體在整體上對外界環境的變化發生最為適宜的反應。白背飛虱唾液腺蛋白參與信號轉導機制表現活躍，推測可能是在取食中遇到外源刺激時，能使機體快速做出積極響應，更高效地吸收營養物質，并進行儲存。KOG分析信號轉導機制中蛋白質多數屬于受體絲氨酸/蘇氨酸激酶及相關蛋白，此類蛋白激酶在信號轉導通路中有一定的關鍵性作用。有研究在蚊子中鑒定到3種絲氨酸/蘇氨酸激酶，它們可能參與了細胞或體液免疫的調節(Chiouetal., 1998)。在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)刺激下，蛋白激酶被證明參與了昆蟲頭角角膜炎血細胞的信號轉導(Charalambidisetal., 1995)。目前蛋白質激酶在昆蟲免疫中的作用仍需進一步研究。

刺吸式昆蟲在不同的發育階段，其唾液成分也會發生改變來應對不同齡期的生理需要。如麥扁盾蝽Eurygasterintegriceps1齡若蟲并不取食，因此其唾液中幾乎不含有淀粉酶，當蟲齡增長、取食增多時，其唾液中的淀粉酶活性也逐漸增強，在3齡期淀粉酶活性達到最強(Kazzazietal., 2005)。李皓(2019)對柑橘木虱Diaphorinacitri雌蟲與雄蟲唾液腺蛋白進行GO和KEGG功能分析發現柑橘木虱雌蟲唾液腺在代謝途徑、脂肪酸生物合成方面比雄蟲唾液腺強。 唾液腺作為一種器官，本身含有的蛋白質種類十分豐富，既有組織蛋白，也有分泌蛋白(馬琳, 2015)。刺吸式昆蟲會根據不同的寄主植物和不同的生理需求，通過唾液組分的改變來達到取食和發育的目的(張燕, 2012)。白背飛虱不同蟲態的唾液腺蛋白存在一定的差異，這可能與不同發育階段和不同性別的取食行為有關。此外，白背飛虱唾液腺蛋白在信號轉導機制方面表現活躍，若蟲81個具有KOG功能注釋的特有唾液腺蛋白中有22個參與信號轉導機制，雄成蟲64個具有KOG功能注釋的特有唾液腺蛋白中有9個參與信號轉導機制，雌成蟲24個具有KOG功能注釋的特有唾液腺蛋白中有3個參與信號轉導機制，相關蛋白或許與取食為害行為存在一定的關系，但此方面還有待進一步的研究。本研究唾液腺蛋白的分類鑒定，可以為探究白背飛虱的刺吸危害提供參考，從而可以為白背飛虱的防控提供相關幫助。如通過干擾重要唾液腺蛋白的表達來抑制白背飛虱的取食或傳毒。