組蛋白H3Ser10磷酸化在家蠶精母細胞減數分裂中的動態分布

張 冰, 邱 礽, 闞云超

(南陽師范學院, 河南省伏牛山昆蟲生物學重點實驗室, 昆蟲生物反應器河南省工程實驗室,中英南陽洛桑昆蟲生物學聯合實驗室, 河南南陽 473061)

作為遺傳物質的載體，大部分的DNA分子在細胞內與組蛋白一起組裝為核小體，核小體高度螺旋纏繞為20 nm染色質絲，染色質絲再凝聚為光鏡下肉眼可見的染色體。在細胞生命周期中，遺傳物質就在染色體上隨著其凝聚、分離和解凝聚而穩定傳遞。伴隨著染色體狀態變化的是組蛋白分子上存在的一系列修飾，這些修飾對于染色體的凝縮、姐妹染色單體之間的黏連以及異染色質的形成都非常重要(Hendzeletal., 1997; Weietal., 1999; Kaszas and Cande, 2000; Fischleetal., 2005; Hirotaetal., 2005)。

真核生物的組蛋白分子包括核心組蛋白H2A, H2B, H3和H4以及連接組蛋白H1，目前關于組蛋白修飾的研究多集中在組蛋白H3上。組蛋白H3在不同物種中都比較保守，同時，一些位點的表觀修飾也相當保守。例如與轉錄活性相關的H3K4甲基化修飾(Vallianatos and Iwase, 2015)，與異染色質沉默相關的H3K9和H3K27的甲基化修飾(Black and Whetstine, 2011)，以及與染色質結構與功能相關的組蛋白磷酸化修飾如H3Ser10ph, H3T3ph和H3T11ph等。雖然這些修飾在很多物種中都比較保守，但是功能卻不盡相同。例如，在四膜蟲和哺乳動物細胞中組蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)伴隨著染色質的濃縮，當第10位的絲氨酸突變為甘氨酸時，染色質的濃縮發生異常(Hendzeletal., 1997; Van Hooseretal., 1998)。然而玉米中H3Ser10ph則是與染色體之間的黏連相關(Kaszas and Cande, 2000)。 具有彌散型著絲粒的昆蟲細胞中H3Ser10ph和染色質的凝縮有關(王姣玲等, 2017)，H3T3ph則與胞質分裂相關(張冰等, 2018)，說明同樣的修飾在不同物種中可能發生了功能分化。

減數分裂是生殖細胞形成單倍性配子的分裂方式。生殖細胞進行減數分裂時，遺傳物質只復制一次，細胞連續分裂兩次，最終形成染色體數目減半的配子。減數分裂周期可以分為間期和分裂期，間期包括G1, S和G2期。分裂期則由減數第一次分裂(meiosis I)和減數第二次分裂(meiosis II)組成。減數第一次分裂分為前期I、中期I、后期I和末期I。其中前期I持續時間較長，根據這個時期染色體的形態變化又將其分為細線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期5個階段(Hillersetal., 2017)。第二次減數分裂與有絲分裂非常相似，包括前期II、中期II、后期II、末期II和胞質分裂II等幾個過程。最終形成染色體數目減半的4個配子。鱗翅目昆蟲精子發育過程中分化產生兩種類型的精子：有核精子和無核精子。有核精子直接與卵細胞結合形成受精卵，無核精子則輔助有核精子與卵細胞的結合。已有的研究表明產生無核精子與有核精子的減數分裂事件存在顯著差異，無核精子精母細胞延遲進入前期I并且在后期產生大量錯分離的染色體，有核精子精母細胞則進行正常的減數分裂過程 (Friedl?nderetal., 2005)。已知H3Ser10ph在昆蟲有絲分裂中參與染色質的凝縮，但是它在家蠶Bombyxmori有核精子和無核精子精母細胞減數分裂中的生物學作用尚不明確。本研究使用特異性抗組蛋白H3Ser10磷酸化的抗體，以4齡幼蟲至蛹期家蠶為實驗材料，應用免疫熒光技術對家蠶精母細胞減數分裂過程中組蛋白H3 Ser10磷酸化在細胞周期中的動態分布進行研究，為探究家蠶有核精子和無核精子精母細胞減數分裂提供基礎。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲及飼養

供試家蠶為大造P50品種,采用新鮮桑葉飼養，飼養溫度25±3℃，相對濕度60%±10%，光周期12L∶12D。解剖4齡幼蟲至蛹期家蠶個體，收集不同時期的精巢組織暫存于1×PBS緩沖液中。

1.2 供試抗體

H3Ser10ph抗體RB7279(P-Ab)由上海吉爾生化有限公司制備(王姣玲等, 2017)；抗組蛋白H3抗體ab1791購自Abcam公司;Tubulin抗體(Anti-Alpha Tubulin Mouse Monoclonal, 66031-1-Ig)購自武漢三鷹生物技術有限公司。

1.3 精巢組織蛋白提取和Western blot檢測H3Ser10ph在精巢中的定位

收集1.1節50頭雄蠶個體的精巢組織，利用蛋白提取試劑盒(KGP150, KeyGEN BioTECH)進行核蛋白和胞漿蛋白提取。對提取所得蛋白進行SDS-PAGE電泳檢測，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入H3Ser10ph抗體或抗組蛋白H3內參抗體(1∶500稀釋, v/v)4℃孵育過夜。二抗使用HRP標記的羊抗兔IgG(1∶2 000稀釋, v/v)，室溫振蕩孵育1 h，以ECL化學發光試劑盒(NCI4106, SHHY)顯色之后凝膠成像系統拍照。

1.4 免疫熒光標記分析H3Ser10ph在精母細胞減數分裂染色體上的定位

將3個不同時期的精巢組織放入同一張加有10 μL 1×PBS的多聚賴氨酸載玻片上，用鑷子壓碎，將碎片夾走，再補充2～3 μL 1×PBS溶液，加5 μL活化的聚丙烯酰胺溶液：100 μL 15% PAGE, 5 μL 20%過硫酸銨(w/v), 5 μL 20%亞硫酸鈉(w/v)，迅速混勻，蓋上薄蓋玻片(18 mm×18 mm)。待膠凝聚之后，取下蓋玻片，將載玻片置于1×PBS中洗兩次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，1×PBS漂洗3次，0.25% Triton X-100透化2 h，1×PBS漂洗3次，3%牛血清蛋白(BSA)室溫封閉1 h，1×PBS漂洗3次。H3Ser10ph抗體(1∶200稀釋, v/v)和Tubulin抗體(1∶1 000稀釋, v/v)混合后，4℃孵育過夜。Alexa FluorR 594標記的羊抗兔IgG(Goat Anti-Rabbit IgG, Jackson ImmunoResearch)(1∶2 000, v/v)和FITC標記的羊抗鼠IgG(Goat Anti-Mouse IgG, Jackson ImmunoResearch)(1∶2 000, v/v)，37℃孵育2 h。最后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI, 0.01 mg/mL+90%甘油)封片固定。利用ZEISS激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

2 結果

2.1 組蛋白H3Ser10ph抗體的特異性分析

對精巢組織所提取的胞漿蛋白和核蛋白(圖1: A)進行H3Ser10ph抗體特異性檢測，Western blot結果顯示在與H3組蛋白分子量相近的17 kD處有一條單一的目的條帶(圖1: B)，表明所使用的抗體可以特異識別家蠶精巢組織中的H3組蛋白，可以作為進一步減數分裂細胞周期定位的抗體進行免疫檢測。

圖1 Western blot檢測家蠶精巢組織中H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)抗體的特異性Fig. 1 The specificity of the phospholated H3 Ser10(H3Ser10ph) antibody in testes of Bombyx moridetected by Western blotA: SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳之后通過考馬斯亮藍染色檢測提取的精巢組織胞漿蛋白(Cy)和核蛋白(N)Detection of cytoplasmic (Cy) and nuclear protein (N) extracted from testes by Coomassie blue staining after SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; B: Western blot檢測精巢組織所提取的胞漿蛋白(Cy)和核蛋白(N)中H3Ser10ph抗體(P-Ab)，組蛋白H3抗體(ab1791)為內參抗體Detection of the H3Ser10ph antibody (P-Ab) in cytoplasmic (Cy) and nuclear protein (N) extracted from testes by Western blot, and the histone H3 antibody (ab1791) is the internal control antibody. MW: 蛋白質分子量標準Protein molecular weight marker.

2.2 H3Ser10ph在有核精子精母細胞減數分裂中的動態分布

對家蠶有核精子精母細胞減數分裂中H3Ser10ph的定位進行觀察，免疫熒光的結果表明：在有核精子精母細胞進入減數第一次分裂前期I的粗線期時即可觀察到H3Ser10ph信號定位在染色體的特定位置(圖2: A)，隨著細胞進入雙線期，染色體上的信號逐漸變弱(圖2: B)，至終變期，信號幾乎完全消失(圖2: C)；當細胞進入中期I時，染色體上又開始出現紅色信號(圖2: D)，而且隨著第一次減數分裂周期繼續進行，染色體上的信號逐漸變多變強，整條染色體上均可以觀察到磷酸化信號，不同位置的信號強弱基本一致(圖2: E)；后期I和末期I時染色體上的信號消失。當細胞進入減數第二次分裂前中期時，染色體臂上的信號消失，在靠近紡錘體微管的分裂面處有彌散的H3Ser10ph抗體的信號(圖2: F, H)；減數第二次分裂末期，僅剩余非常微弱的H3Ser10ph信號殘留于染色體的特定位置(圖2: G)。

圖2 組蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)抗體在家蠶有核精子精母細胞的定位Fig. 2 Localization of the phosphorylated histone H3Ser10 (H3Ser10ph) antibodyduring eupyrene spermatocytes of the silkworm, Bombyx moriA: 粗線期，H3Ser10ph抗體的信號出現在染色體的一些區域At the pachytene, the H3Ser10ph antibody signals appear in some regions of chromosome; B: 雙線期，H3Ser10ph抗體的紅色熒光信號變弱 At the diplotene, the red fluorescent signals of the H3Ser10ph antibody become faint; C: 終變期，H3Ser10ph抗體的信號完全消失 At the diakinesis, the H3Ser10ph antibody signals completely disappear; D: 中期I，染色體上又開始出現一些較強的H3Ser10ph抗體的信號 At the metaphase I, some of strong fluorescent staining signals of H3Ser10ph are localized on the chromosome; E: 中期I，H3Ser10ph抗體的信號在整條染色體上分布At the metaphase I, the H3Ser10ph antibody signals spread along the whole chromosomes; F: 前中期II，在靠近微管的分裂面處有彌散的H3Ser10ph抗體的信號，如放大圖H中箭頭所示At the metaphase II, there is holo-shaped fluorescent signal of the H3Ser10ph near the microtubulin attaching side, as shown by the arrows in enlarged view H; G: 末期II，僅剩余非常微弱的H3Ser10ph抗體的信號，藍色信號示DAPI，紅色示H3Ser10ph抗體的信號, 綠色示α-微管蛋白。At the telophase II, there are very weak staining signals of the H3Ser10ph antibody. DAPI is indicated with blue signal, the H3Ser10ph antibody with red, and α-tubulin with green. 標尺Bars=10 μm.

2.3 H3Ser10ph在無核精子精母細胞減數分裂中的動態分布

對家蠶無核精子精母細胞減數分裂中H3Ser10ph的定位進行觀察，免疫熒光的結果表明：與有核精子精母細胞中的H3Ser10ph信號相似，在無核精子精母細胞減數分裂粗線期可觀察到信號定位在染色體的特定位置(圖3: A)，隨著細胞進入第一次減數分裂中期I時，染色體上的信號逐漸變多變強，整條染色體上均可以觀察到磷酸化信號，不同位置的信號強弱基本一致(圖3: B)。不同的是，后期I，伴隨著紡錘絲將同源染色體拉向兩極，H3Ser10ph的信號依然均勻分布在染色體上(圖3: C)；而且與有核精子精母細胞紡錘體與同源染色體結合不同，在無核精母細胞后期I時，紡錘絲微管與赤道面平行排列。當細胞進入末期I時，分離到兩端的染色體上依然存在H3Ser10ph抗體的信號(圖3: D)，減數第二次分裂中期，染色體臂上的信號消失，在靠近紡錘體微管的分裂面處有彌散的H3Ser10ph抗體的信號(圖3: E)。

圖3 組蛋白H3Ser10磷酸化(H3Ser10ph)抗體在家蠶無核精子精母細胞的定位Fig. 3 Localization of the phosphorylated histone H3Ser10 (H3Ser10ph) antibodyduring apyrene spermatocytes of the silkworm, Bombyx moriA: 粗線期，H3Ser10ph抗體的信號出現在染色體的一些區域At the pachytene, the H3Ser10ph antibody signals appear in some regions of chromosome; B: 中期I，H3Ser10ph抗體的信號在整條染色體上分布 At the metaphase I, the H3Ser10ph antibody signals spread along the whole chromosomes; C: 后期I，H3Ser10ph抗體的信號依然存在于整條染色體上At the anaphase I, the H3Ser10ph antibody signals spread along the whole chromosomes; D: 末期I，分離到兩端的染色體上依然存在較強的H3Ser10ph抗體的信號At the anaphase I, strong fluorescent staining signals of the H3Ser10ph antibody are still localized on the chromosome separated to both ends; E: 中期II，在靠近微管的分裂面處有彌散的H3Ser10ph抗體的信號 At the metaphase II, there is holo-shaped fluorescent signal of the H3Ser10ph antibody close to the microtubulin attaching side. 藍色信號示DAPI，紅色示H3Ser10ph抗體的信號, 綠色示α-微管蛋白。DAPI is indicated with blue signal, the H3Ser10ph antibody with red, and α-tubulin with green. 標尺Bars=10 μm.

3 討論

減數分裂中DNA復制一次，而細胞連續分裂兩次，為了保證染色體的正確分離，細胞中存在許多精確的調控機制。其中，DNA復制之后定位在染色體上的黏連蛋白從染色體上的逐步降解對于染色體的正確分離至關重要(Hirano, 2000)。減I后期，姐妹染色單體臂上的黏連蛋白在CK1激酶的作用下被降解，而著絲粒區的黏連蛋白則在一種被稱為SHUGOSHIN蛋白的保護下直到減II后期才會被降解(Ishiguroetal., 2010)，在著絲粒區殘留的黏連蛋白對于動粒蛋白與紡錘絲微管之間的張力維持很重要。SGO1在染色體上的重分布對于染色體的正確分離很關鍵(Liuetal., 2013)。

家蠶作為鱗翅目的模式物種，它所擁有的彌散型著絲粒染色體既丟失了著絲粒區表觀蛋白CENH3，又丟失了動力蛋白CENPA和CENPC(Drinnenbergetal., 2014)，暗示在家蠶中可能有不依賴于這些蛋白的動粒組裝模式。最近的研究表明CENP-T(Cortes-Silvaetal., 2020)和CENP-N(Lietal., 2019)在家蠶不依賴CENH3的動粒組裝中發揮重要作用。對家蠶有核精子和無核精子精母細胞的研究發現，與有核精子精母細胞中心粒周期性地與核膜結合不同，無核精子精母細胞明顯缺乏中心粒與細胞核的附著(Yamashiki and Kawamura, 1998)。舞毒蛾精母細胞細胞學的研究結果表明無核精子精母細胞在前期I同源染色體不完全配對聯會，存在單價體，核仁不融合，后期I染色體分離異常(Reinholdtetal., 2002)。

本研究利用特異識別H3Ser10ph抗體，在家蠶精巢組織中利用免疫熒光技術，研究了這一保守的組蛋白翻譯后修飾在家蠶有核精子和無核精子精母細胞減數分裂中的動態分布(圖2和3)。結果表明，粗線期H3Ser10ph修飾在兩種類型的精母細胞中均出現點狀信號，至中期I，高度凝縮的染色體上均勻分布較強的信號；不同的是，在無核精子精母細胞后期I至末期I時持續在染色體上存在均一的信號，與染色體持續凝縮的狀態相一致，而且后期I時紡錘絲與赤道面平行而不是垂直(圖3: C)，說明H3Ser10ph可能參與家蠶有核精子和無核精子精母細胞減數分裂后期I至末期I的調控，暗示減I存在異常分離的無核精子精母細胞染色質去凝縮也出現異常。結合H3Ser10ph修飾在草地貪夜蛾Sf9細胞有絲分裂中參與染色質凝縮的功能，推測該修飾在鱗翅目的彌散型著絲粒染色體上參與染色質凝縮與去凝縮的調控。未來可以通過克隆家蠶中催化組蛋白磷酸化修飾的相關蛋白激酶進行深入的功能研究。該結果為進一步探討組蛋白翻譯后修飾在家蠶精母細胞減數分裂中的功能提供了前期基礎。