茶粉均質性的紅外光譜相似度評價研究

伍賢學，李 明，李亮星，鄧秀娟，馬憲英，李亞莉，周紅杰*

1.云南農業大學龍潤普洱茶學院,云南 昆明 650201 2.玉溪師范學院化學生物與環境學院，云南 玉溪 653100 3.昆明易武鴻慶茶業有限責任公司,云南 昆明 650000

引 言

紅外光譜法是一種經典的有機結構分析手段，近年來越來越廣泛的用于生物醫藥、石油化工、農業食品等諸多混合物分析領域，具有直接、簡單、快速、低碳等優點[1]。研究表明，指紋性和可解析性是混合物紅外光譜的兩個基本屬性。近十多年來，孫素琴等在中藥、食品等復雜體系的紅外光譜分析領域進行了系統研究并取得一系列成果，奠定了混合物紅外光譜分析的理論基礎[2-3]。

準確的信號是定性和定量分析的基礎，是實現分析結果準確可靠的前提[4]。非均質樣品的均質化處理不足可能嚴重影響分析結果的可靠性，特別是對于單次取樣量低至毫克甚至微克的固態樣品紅外光譜分析更是如此。茶葉和其他很多復雜固體樣品一樣，屬于典型的非均質樣品。粉碎是茶葉分析的常規前處理環節，我國國家標準(GB/T 8303)也對茶樣預處理過程中的粉碎環節進行了相應規定。但不論是茶葉水浸出物、茶多酚、游離氨基酸、總生物堿等常規理化分析，還是茶葉中兒茶素、茶氨酸、咖啡因或香氣成分分析，單次分析的取樣量(或預處理取樣量)通常都在1 000 mg以上，而茶粉的紅外光譜(KBr)測試單次取樣量約1 mg甚至更低。因此，直接利用常規成分測定所需的茶樣粉末進行紅外光譜測試，所得光譜可能無法準確反映茶樣的整體信息，以此為基礎的紅外光譜分析可能存在較大的誤判風險。非均質樣品的紅外光譜分析中的這一問題尚未引起足夠重視，從諸多文獻的紅外光譜圖上可以看出較為普遍的存在樣品量過載、基線傾斜、信噪比偏低等不太注重紅外光譜質量的現象[5-8]。迄今為止亦鮮見紅外光譜分析對樣品均質化程度要求的有關報道。本課題組近年來一直從事茶葉等復雜樣品紅外光譜相關研究[9-10]。研究發現，弄清高質量紅外光譜對茶粉均質化程度的要求對于茶葉的紅外光譜深入研究十分必要。得益于光譜軟件技術及化學計量學方法的發展成果，利用紅外光譜相關系數(r)可以方便地對光譜相似度進行評價[1]。

云南是世界茶樹原產地中心地帶。具有獨特的云南大葉種茶樹資源優勢，擁有普洱生茶、普洱熟茶、滇紅茶等特色鮮明的茶葉品種。三類茶葉產品均由云南大葉種茶樹幼嫩芽葉經不同工藝加工而成，三類茶可以分別歸為不發酵茶、后發酵茶和全發酵茶，茶葉化學組成存在顯著差異。

為此，以三類滇產茶為實驗材料，通過紅外光譜相似度評價茶葉粉碎粒徑對紅外光譜質量的影響，優化茶葉均質化粉碎條件，以便于盡可能少的光譜采集次數獲取可靠的紅外光譜分析信號，為基于茶葉紅外光譜分析的相關研究打下堅實的基礎。預期研究成果可為茶葉的紅外光譜研究過程中的樣品均質化前處理實驗提供科學指導，也可為其他非均質固態樣品的紅外光譜分析提供參考。

1 實驗部分

1.1 樣品處理

選取普洱生茶(Raw-PE)、普洱熟茶(Riped-PE)、滇紅茶(YNBT)三類茶樣作為研究對象，所有茶樣均由昆明易武鴻慶號茶葉有限公司提供。

各取茶樣100 g，除塵后盛于烘樣鋁盒中于60 ℃的烘箱中干燥4 hrs。取出冷至室溫后，勻堆取出10 g用多功能粉碎機(國產)粉碎2 min，茶粉依次過60，120和250目不銹鋼分樣組篩，制得A(60目以下)、B(60～120目)、C(120～250目)及D(250目以上)四種不同粒徑范圍的茶粉，分裝收集編號后于干燥器中保存備紅外光譜測試用。

1.2 儀器參數及方法

PE Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀(Perkins-Elmer)；通用金剛石單點衰減全反射紅外光譜附件(UATR)；氘代硫酸三甘氨酸酯(DTGS)檢測器；KBr法光譜掃描范圍：4 000～400 cm-1；ATR法光譜掃描范圍：4 000～650 cm-1；光譜分辨率為4 cm-1，累計掃描16次，掃描時自動扣除H2O和CO2的干擾；每個茶樣平行測試五次；原始紅光譜依次執行T-A轉換、基線校正、歸一化等標準化處理后用于光譜相似度評價。光譜采集及處理利用PE公司紅外光譜專業軟件(Spectrum 10.4)完成；光譜相似度評價采用PE紅外光譜軟件自帶Compare軟件完成，優選光譜評價范圍為1 800～700 cm-1。

透射法(KBr)紅外光譜測定：取茶樣粉末約1 mg與約100 mg溴化鉀碎晶(光譜純，自貢三川公司)混合研磨均勻后放入壓片模具，8噸壓力下保持2 min，隨后將樣品片用樣品夾固定后放入樣品倉進行測試。

ATR法紅外光譜測定方法：取少許茶粉置于金剛石UATR平臺，壓力桿保持在同一壓力條件下測試。

2 結果與討論

2.1 全體茶樣間的紅外光譜相似度評價

為從總體上了解不同茶類、粒徑茶樣之間的相關性，以普洱生茶250目以上粒徑樣品的第五次平行KBr光譜為參比，對3類茶樣、4種粒徑各5個平行樣共60個KBr譜的1 800～700 cm-1波數段進行相似度評價，相關系數(r)均以夾角余弦值計算，即

其中，每個紅外光譜(光譜矩陣x的一行)被視為由n個可變坐標產生的n維空間中的向量，兩個光譜之間的相似性由兩個向量之間夾角的余弦定義；wk為扣除水蒸氣和二氧化碳的吸收干擾的噪聲權重因子。評價結果見表1。

首先，從表1可見，以Raw-PE<250-5的KBr譜為參比，普洱生茶的相關系數范圍為1.000 0～0.993 2，滇紅茶與普洱熟茶相應的相關系數范圍分別為0.930 0～0.756 3和0.644 7～0.562 9，3類茶的相關系數范圍存在顯著差異，容易通過相似度評價進行區分，20條滇紅茶光譜中與參比光譜相關性最好的為YNDH 250-2(r=0.930 0)，普洱熟茶的為Riped-PE 120-5(r=0.644 7)。對20條類內光譜對應的相關系數變化幅度進行考察，發現除了普洱生茶的變化幅度小于1%之外，普洱熟茶的達到8%，滇紅茶的更是超過17%。該結果說明粉碎粒徑對不同茶類均質性影響明顯不同，這可能與三個茶樣的加工原料老嫩程度不同有關。

表1 不同茶類、粒徑茶樣的紅外光譜(KBr)相似度評價結果Table 1 Similarity evaluation results of different tea samples based on FTIR (KBr) spectra

2.2 不同粒徑、茶類及光譜采集方式的紅外光譜差異分析

圖1給出了3類滇產茶的4種粒徑茶粉共60條KBr譜重疊圖，圖2是相應的ATR譜重疊圖。所有紅外光譜均按實驗方法所述進行標準化處理并選取1 800～700 cm-1波數范圍進行相似度評價，不同譜線用不同顏色、線型標記，標記詳情見圖注。從圖1可以看出，三類茶樣呈現出明顯不同的紅外光譜吸收特征，吸收峰差異在3 500～3 000和1 600～1 000 cm-1范圍內表現得最為明顯，普洱生茶的吸收峰相對最強、普洱熟茶的吸收峰相對最弱。還可看出，不同茶類間的譜線趨于分離，而同類茶間的譜線則更趨于聚攏重疊，3類茶中滇紅茶光譜表現相對較差。圖2中三類茶呈現出與圖1類似吸收特征，但在1 600～1 000 cm-1范圍內光譜的類間差異更加突出、類內差異相對更小。此外，2 000 cm-1附近為ATR譜普遍存在的噪音峰，對光譜標準化處理具有一定不利影響。

圖1 溴化鉀法紅外光譜重疊圖(1 900～500 cm-1)綠色:普洱生茶;紅色:滇紅茶;藍色:普洱熟茶Fig.1 Stacked plot of FTIR (KBr) spectra (1 900～500 cm-1)green:Raw-PE;red:YNBT;blue:Riped-PE

圖2 衰減全反射紅外光譜重疊圖(1 900～600 cm-1綠色:普洱生寵;紅色:滇紅茶;藍色:普洱熟茶Fig.2 Stacked plot of ATR-FTIR spectra (1 900～600 cm-1)green:Raw-PE;red:YNBT;blue:Riped-PE

光譜差異反映了茶樣組成差異，可通過重疊光譜圖中的譜線重疊程度直觀表現，這些直觀的視覺差異可以通過光譜間的歐式距離、夾角余弦值、皮爾森線性相關系數等進行量化表達。上述結果表明，3類茶樣的均質化程度受粉碎粒徑影響并不一致，普洱生茶的均質性最好，滇紅茶的均質性最差，該評價結果與前文的結果一致。

2.3 基于平行光譜的相似度評價結果與分析

表2 KBr法的平行紅外光譜相似度評價結果Table 2 Similarity evaluation based on parallel FTIR (KBr) spectra

表3 ATR法平行紅外光譜的相似度評價結果Table 3 Results of similarity evaluation based on parallel ATR-FTIR spectra

上述結果表明，粒徑、茶類及光譜采集方式均可能影響光譜相似度評價結果。均質性與茶類相關，本研究中普洱生茶比滇紅茶、普洱熟茶表現出更好的均質性；均質性與茶粉粒徑成負相關，粒徑越小，均質性越高；就兩種光譜采集方式比較結果而言，KBr譜比ATR譜表現出更強的差異區分能力，可能更適合用于組成類似樣本間的差異分析。

2.4 基于同類茶20個光譜間的相似度評價結果與分析

前文平行光譜評價結果表明茶樣的均質性與茶粉粒徑呈負相關，250目以上茶樣的均質性最好。故以250目以上茶樣光譜為參比對來自于同類茶、不同粒徑的20個光譜進行相似度評價，并以下劃線標記出與參比相似度較低的r值(<0.99)。表4、表5分別為基于KBr譜和ATR譜的評價結果，表中還分別給出了同粒徑、同茶類以及同一光譜采集方式的r均值。

從表4、表5可以看出，普洱熟茶、滇紅茶及普洱生茶20個KBr譜的r值中低于0.990 0的分別有10，10及0個，而相應的ATR譜結果分別為6，13及4個。值得注意的是，43個低于0.990 0的r值中，除了3個源于滇紅茶120目以上樣品的ATR譜之外，其余40個全部源于120目以下的茶樣?；贙Br譜的同類茶比較，(rRaw-PE(0.997 7)>(rRiped-PE(0.980 2)>(rYNDH(0.970 9)，相應的ATR譜結果為(rRaw-PE(0.992 3)>(rRiped-PE(0.991 8)>(rYNDH(0.987 6)?；贙Br譜的同粒徑比較結果為(rD(0.999 4)>(rC(0.996 7)>(rB(0.983 6)>(rA(0.952 0)，相應的ATR譜結果為(rD(0.999 2)>(rC(0.992 8)>(rB(0.988 8)>(rA(0.981 6)。此外，60個KBr譜r均值為0.991 6，低于相應的ATR譜均值0.993 3。

表4 同類茶、不同粒徑的20個KBr譜的相似度評價結果Table 4 Similarity evaluation of the same kind of tea samples with different particle sizes based on 20 IR spectra (KBr)

表5 同類茶不同粒徑的20個ATR譜的相似度評價結果Table 5 Similarity evaluation of the tea samples with same type but different particle sizes based on 20 ATR-FTIR spectra

該評價結果進一步表明普洱生茶相對于另外兩種茶樣具有更好的均質性。更重要的是，結果表明粉碎粒徑大小可能嚴重影響茶粉的均質化程度，利用粉碎均質化程度不足(120目以下)的茶粉紅外光譜分析茶葉化學組成可能導致光譜不能真實反映樣本化學組成信息。兩種光譜采集方式結果對比分析表明，KBr譜對樣品間的組成差異反映更為靈敏，更適合組成高度相似的同類樣本間的差異識別與分析。

3 結 論

對3類滇產茶樣的不同粒徑茶粉進行KBr法和ATR法紅外光譜的一系列相似度評價研究。不同茶類對比表明，普洱生茶茶樣比普洱熟茶和滇紅茶茶樣的均質化程度更高，這可能與加工普洱熟茶、滇紅茶的茶箐原料比普洱生茶原料稍顯粗老、茶梗木質化程度稍高有關。不同光譜采集方式研究結果表明，雖然ATR平行光譜表現出更好的重現性，但KBr譜明顯具有相對更好的樣品間差異識別能力，更適合用于茶葉產品這樣的組成高度相似的同類樣本間的差異識別與分析。對不同粒徑茶粉的研究結果表明，茶粉的均質化程度與茶粉粒徑密切相關，粒徑越小，均質化程度越高。非均質樣品的充分均質化前處理是取得可靠分析結果的基本保障，這對于單次測試取樣量低至1 mg的紅外光譜(KBr)分析而言尤為如此。一般而言，120目以上的茶粉粒徑可讓KBr譜達到r>0.995，但若基于ATR譜進行分析，最好將茶樣粉碎至250目以上。

值得指出的是，雖然樣品的均質化程度和樣品間的組成差異可以方便地通過紅外光譜相似度進行量化評價，但對于具體分析樣本而言，研究確定可靠的相似度評價閾值非常重要，簡單利用相似度評價結果可能存在潛在的誤判風險。