RNA靶向的CRISPR/CasRx系統在小鼠精原細胞系GC1-spg中的應用

李夢真，柳 俊，鄒定峰，繆時英，王琳芳，宋 偉，李 凱

(中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 醫學分子生物學國家重點實驗室， 北京 100005)

成族規律間隔短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)/CRISPR關聯因子(CRISPR associated,Cas)系統是細菌和古細菌物種抵御入侵的噬菌體和核酸中的外來遺傳元件的一種免疫應答方式[1]，其通過各種CRISPR/Cas系統的RNA引導的核酸內切酶結合和切割外來遺傳元件而發揮作用[2]。盡管在先前的報道中，CRISPR/Cas9系統已經被廣泛應用于在DNA層面進行基因編輯以剖析特定遺傳元件的功能或糾正致病突變[3]，但當不適合對基因組DNA進行永久修改(例如敲除致死) 以及涉及生物安全問題時，或者用于治療RNA病毒感染疾病(例如SARS-CoV-2感染)[4]時，RNA靶向基因編輯技術就尤為重要。CasRx是CRISPR系統中鑒定出的一種新的、由RNA引導的、靶向RNA的Cas核酸酶，其能夠實現對轉錄組高效和特異的敲降[5]。迄今為止，CRISPR/CasRx介導的基因沉默已經被廣泛使用，例如抑制胰腺導管腺癌的發生發展[6]小鼠中用于神經細胞命運操縱[7]、肝臟代謝調節[4]、預防新血管形成以及植物[8]和胚胎[9]中特異基因敲降。盡管RNA靶向的CRISPR/CasRx系統具有廣泛的應用前景，但是在雄性生殖領域中還未有相關應用的報道。本項研究驗證了CRISPR/CasRx在HEK-293T細胞中可敲降egfp(enhanced green fluorescent protein)和mCherry外源基因，以及特異敲降HEK-293T細胞內源基因，包括mRNA和lncRNA(long non-coding RNA)。為了評估CRISPR/CasRx系統在雄性生殖領域中的應用潛力，選取了GC1-spg細胞并利用該系統靶向egfp和mCherry外源基因進行了驗證。

1 材料與方法

1.1 材料

人胚腎細胞系293T(human embryonic kidney cell line,HEK-293T)、小鼠精原細胞系GC1-spg(本課題組保存)；EF1a.CasRx.2A.EGFP、CasRx.pregRNA cloning backbone(武漢淼靈生物科技有限公司)；lenti.Guide.mCherry、lenti.Guide. tdTomato(王曉月教授饋贈)；DMEM高糖培養基(HyClone公司)；Fatal bovine serum(Gibco公司)；Opti-MEM培養基、penicillin-streptomycin(Life Technologies公司)；Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix、T4 DNA Ligase(NEB公司)；5×DNA loading dye(Generay公司)；Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、SYBR Green Master Mix、Fast DigestPacⅠ(Thermo Fisher Scientifical公司)；PEI(Polysciences公司)；瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質粒中提試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)；SDS-PAGE快速凝膠試劑盒(上海雅酶生物科技有限公司)；E.coliTrans5αChemically Compe-tent Cell(TransGene Biotech公司)；EcoRⅠ(TaKaRa公司)；GFP antibody(Cell Signaling公司)；mCherry antibody(Proteintech公司)；引物(北京擎科生物科技有限公司合成,見表1，2)；gRNA序列(北京天一輝遠生物科技有限公司合成,見表3)。

表1 PCR及測序引物序列Table 1 Primers for PCR and sequenc

表2 實時熒光定量PCR(q-PCR)引物序列Table 2 Real-time fluorescent quantitative PCR(q-PCR) primer sequence

表3 gRNA序列Table 3 gRNA sequence

1.2 方法

1.2.1 質粒的構建：利用SnapGene設計lenti. EF1a.EGFP、lenti.EF1a.mCherry、lenti.EF1a. tdTomato目的質粒，Q5高保真PCR Mix擴增目的片段，同時使用PacⅠ和EcoRⅠ內切酶酶切慢病毒表達載體，純化回收目的片段。使用同源重組酶連接目的片段和載體，轉化E.coliTrans5α感受態細菌內，12 h后挑取單克隆菌落，送擎科公司進行測序，比對測序結果后，質粒提取。同上方法,PCR獲得EF1a core promoter、CasRx、SV40、U6-DRs和載體片段，連接到AAV表達載體，測序比對后質粒提取。

1.2.2 瞬時轉染：在6孔板培養皿內鋪約106個細胞，17 h后換液。配置轉染試劑，按照1∶1的比例加入Max轉染試劑，靜置30 min后滴加入培養基內，24 h后換為正常的DMEM，48 h后收細胞進行檢測。

1.2.3 細胞培養：HEK-293T細胞及GC1-Spg細胞均在DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素)、5% CO2、37 ℃恒溫培養。

1.2.4 gRNA設計及連接：gRNA設計于https://cas13design.nygenome.org，將得分前3名的gRNA進行比對之后合成。通過BplⅠ內切酶酶切AAV.EF1a.CasRx.U6.DRs載體以及合成的gRNA片段，T4 DNA連接酶連接。

1.2.5 Western blot檢測蛋白的表達：用1×SDS 80 μL裂解細胞樣品，100 ℃變性，12 000 r/min離心5 min吸取上清，棄去細胞碎片，用BCA法進行蛋白定量。用10% SDS-PAGE快速凝膠試劑盒，加入蛋白樣品，使用相應的抗體進行檢測。

1.2.6 q-PCR檢測mRNA水平：1 mL Trizol加入細胞沉淀內，加入異丙醇12 000 r/min 15 min離心獲取沉淀，使用70%冰乙醇進行洗滌2遍，使用預熱的DEPC水進行溶解。

1.2.7 流式細胞分選術分析陽性細胞：使用0.25%胰蛋白酶將細胞消化下來后，PBS洗滌細胞1遍，之后使用40 μm濾膜進行過濾，使用流式細胞儀進行EGFP和mCherry陽性細胞的分選，使用FlowJo軟件分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 構建CasRx-gRNA 表達質粒和熒光表達質粒

通過PCR擴增獲得對應長度的目的片段，測序結果連接成功且無突變，經質粒提取獲得EF1a core promoter.CasRx.SV40.U6.DRs質粒(圖1A，B)。通過PCR擴增獲得對應長度的目的片段和酶切后的載體片段，質粒提取獲得3種熒光表達質粒(圖1C，D)。

A.AAV-CasRx-gRNA plasmid map；B.PCR products of EF1a core promoter，SV40，U6-DRs，CasRx，AAV-vector；C.EGFP，mCherry，tdTomato fluorescent protein expression vectors；D.PCR products of EF1a promoter，EGFP，mCherry，tdTomato圖1 CasRx-gRNA和EGFP、mCherry、tdTomato熒光蛋白表達載體的構建Fig 1 Construction of CasRx-gRNA and EGFP，mCherry，tdTomato fluorescent proteins expression vectors

2.2 HEK-293T細胞內驗證CRISPR/CasRx系統的特異性和高效性

通過網站設計以及文獻查閱獲得EGFP和mCherry相應gRNA，將gRNAEGFP和gRNAmCherry序列插入EF1a core promoter.CasRx.SV40.U6.DRs質粒DR-DR之間,獲得目的質粒(圖2A)。在瞬時轉染熒光蛋白表達質粒和CasRx+gRNA 48 h后，檢測3種熒光的表達，其中EGFP和mCherry熒光為實驗組，tdTomato為對照組，CasRx+gRNAEGFP、CasRx+gRNAmCherry組EGFP綠色熒光和mCherry紅色熒光顯著減弱，tdTomato熒光強度不變(圖2B)。分別檢測EGFP綠色熒光和mCherry紅色熒光蛋白的表達水平顯著降低(圖2C)。

A.AAV-CasRx-gRNA plasmid design strategy；B.fluorescence expression after HEK-293T knockdown(×20)；C.detection of the expression of EGFP and mCherry protein level by Western blot; WT.wild type圖2 CRISPR/CasRx在HEK-293T細胞內靶向沉默外源基因的表達Fig 2 CRISPR/CasRx targetedly silenced the expression of exogenous genes in HEK-293T cells

2.3 CRISPR/CasRx系統在HEK-293T細胞系內有效敲降內源基因

選取一組EK-293T內源表達的蛋白質編碼基因(mRNA)B4GALNT1、ANXA4，和一組長非編碼RNA(lncRNA)MALAT1和H19，設計相對應的gRNA靶點(圖3A)，獲得目的質粒。分別檢測瞬時轉染48 h后RNA水平，顯示CasRx+gRNA能夠有效敲降內源表達的mRNA和lncRNA(圖3B)。

A.design for non-targeting(NT),B4GALNT1,ANXA4,MALAT1,H19 targeting；B.detection of the expression of B4GALNT1,ANXA4,MALAT1,H19 by q-PCR；*P<0.01 compared with NT guide圖3 CRISPR/CasRx在HEK-293T細胞內靶向沉默內源基因的表達Fig 3 CRISPR/CasRx targetedly silenced the expression of endogenous genes in HEK-293T

2.4 CRISPR/CasRx系統在GC1-spg細胞內有效敲降外源基因

在瞬時轉染熒光蛋白表達質粒和CasRx+gRNA于GC1細胞48 h后，檢測顯示綠色熒光和紅色熒光強度都顯著減弱(圖4A)。流式細胞分選陽性細胞顯示CasRx+gRNA組熒光的強度較高的細胞數量顯著減少(圖4B)。檢測熒光蛋白的RNA和蛋白表達水平，顯示CasRx+gRNA組能夠有效敲降外源的兩種不同的熒光蛋白(圖4C，D)。

A，B.fluorescence intensity after knockdown EGFP and mCherry of GC1-spg(×20)；C.detection for expression of EGFP and mCherry by q-PCR after egfp and mCherry knockdown of GC1-spg，*P<0.01 compared with CasRx group；D.detection for expression of EGFP and mCherry protein level by Western blot after egfp and mCherry knockdown of GC1-spg; WT.wild type圖4 CRISPR/CasRx在GC1-spg細胞內靶向沉默外源基因的表達Fig 4 CRISPR/CasRx targeted the expression of exogenous genes in GC1-spg

3 討論

CRISPR/CasRx系統最直接的應用是靶向沉默RNA。目前此系統被證實可以在哺乳動物細胞系中干擾RNA，從而實現基因沉默。本研究通過構建熒光表達質粒和針對目的egfp敲降的AAV-CasRx-gRNA質粒,從熒光表達差異直觀的證明了CRISPR/CasRx發揮敲降功能的高效性， 在HEK-293T細胞系和小鼠精原細胞系GC1-spg通過對目的基因進行敲降，結果顯示敲降效率均在50%以上，包括mRNA和lncRNA。據報道，小鼠睪丸組織存在大量特異表達的lncRNA，傳統的RNA干擾技術靶向沉默lncRNA的效率不甚理想，特別是針對細胞核內的lncRNA，而CRISPR/CasRx系統介導的基因沉默不受此限制，可在體內體外水平高效沉默lncRNA。在CRISPR/CasRx設計gRNA方面，此系統不需要PAM(protospacer adjacent motif)序列，無核苷酸識別序列要求，在設計gRNA時操作簡易。本研究連接了針對目的基因的3個gRNA，3個gRNA進行比對時均無脫靶，證明了現階段在設計gRNA方面，https://cas13design.nygenome.org網站的實用性和高度可信性[10]。同時對于gRNA，已報道在circular RNA方面的篩選功能[11]，表明此系統對于高通量篩選出功能性RNA的應用前景較好。另一方面，現階段發現的Cas13d同源物中CasRx蛋白體積最小，僅930 aa(氨基酸)，適用于包裝入現階段較安全的AAV病毒載體中，而且非常特異，在RNA水平上極少產生脫靶效應，讓其在安全性以及潛在的疾病治療上擁有了巨大的優勢。CRISPR/CasRx結合AAV病毒運載系統已經在小鼠模型上被證明可用于基因治療的多種疾病的發生發展。

體內水平注釋基因功能是研究精子發生的理想模型。在研究某個基因在精子發生完整過程中的功能及機制時，較穩定的方式是制備基因敲除鼠，但敲除鼠只能展現該基因缺失的最終結果且存在潛在的致死效應[12]，無法展現該基因被干擾的一個動態變化，而CRISPR/CasRx系統可以實現在小鼠體內進行RNA編輯進而檢測其干擾后下游基因的表達情況。所以，結合CRISPR/CasRx系統的功能特征和雄性生殖發育研究現狀，CRISPR/CasRx系統應用于雄性生殖發育研究具有較好前景。本研究中構建的AAV-CasRx-gRNA表達載體也是為應用于雄性生殖研究的小鼠模型上。同時CRISPR/CasRx系統在小鼠精原細胞的應用也為此系統應用于雄性生殖研究中奠定了基礎。