食欲素A促進短暫性全腦缺血大鼠的海馬CA1區谷氨酸攝取并抑制遲發性神經元死亡

周 鴻，鄧 健，楊 鋒，余 杰，胡林旺*

(湖南省人民醫院 1.神經外二科，2.藥學二部，湖南 長沙 410002)

突觸間隙內谷氨酸的過量蓄積導致的興奮性毒性是缺血性腦損傷(ischemic brain injury，IBI)的重要機制之一，并且是神經二次損傷和病后轉歸主要的不良因素[1]。膠質細胞谷氨酸轉運體-1(glial glutamate transporter 1，GLT-1)承擔了約90%的中樞神經系統的谷氨酸轉運，且80%以上的GLT-1表達于海馬[2]。海馬CA1區對缺氧缺血最為敏感，且海馬CA1區錐體層神經元損傷會導致認知、學習和記憶功能障礙，直接導致IBI患者的不良預后[3]。因此，研究海馬CA1區GLT-1的表達與功能對研究IBI后的興奮性谷氨酸毒性反應至關重要。

在IBI患者腦脊液中食欲素A(orexin-A，OX-A)含量降低，且OX-A低含量與IBI嚴重程度呈正相關[4]。側腦室注射OX-A能降低腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠的腦梗死體積[5]。以上現象提示：OX-A可能具有抗IBI的效應。而OX-A對短暫性全腦缺血(transient global cerebral ischemia，tGCI)中GLT-1的表達、轉運活性以及對谷氨酸攝取能力仍不清楚，因此本研究觀察側腦室注射OX-A對tGCI大鼠海馬CA1區GLT-1表達與功能的影響，并分析其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑

30只7周齡SPF級雄性SD大鼠[長沙市天勤生物技術有限公司，SCXK(湘)2019-0014]；OX-A試劑和LY294002[phosphotidylinsitol-3-kinase(PI3K)抑制劑]試劑(MedChemExpress公司)；谷氨酸定量試劑盒和硫堇溶液(北京索萊寶生物科技有限公司)；Fluro-Jade C(FJ-C)染色試劑盒(Chemicon公司)；膜蛋白提取試劑盒(上海生工生物工程有限公司)；[3H]-glutamate試劑(PerkinElmer公司)；DHK試劑(Sigma-Aldrich公司)；NeuN、GLP-1、PI3K、p-PI3K、AKT和p-AKT抗體(Cell Signaling Technology公司)；BCA蛋白定量試劑盒、ECL化學發光試劑盒、GAPDH抗體和HRP標記二抗(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：將大鼠隨機分為假手術(sham)組(n=6)和tGCI造模組(n=24)。采用改良四血管閉塞法對大鼠進行tGCI造模，缺血10 min后，恢復血液灌流[6]。將18只造模成功的大鼠隨機分為模型(model)組、OX-A組(造模后1 d，側腦室注射給藥30 μg/kg OX-A)和OX-A+LY294002組(100 μg/kg LY294002)3個亞組，每個亞組納入6只大鼠。側腦室微量注射儀進針位置為前鹵后0.8 mm，向右1.5 mm，深度3.8 mm，注射速度為1 μL/min，注射后留針8 min。注射后2 d進行后續實驗。

1.2.2 腦海馬CA1區組織樣本收集：麻醉大鼠后，斷頭取腦，分離腦組織留存，然后通過解剖顯微鏡分離出海馬CA1區組織。

1.2.3 Western blot檢測GLP-1、p-PI3K和p-AKT蛋白表達：用RIPA試劑分離各組海馬CA1區組織的總蛋白，用常規Western blot孵育GLP-1、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT和GAPDH抗體。并在曝光顯影后，用Image J軟件定量各樣本目的條帶的吸光度值。

1.2.4 [3H]-glutamate放射性配基-受體結合實驗檢測海馬CA1區GLT-1的結合能力和對谷氨酸的攝取能力：用膜蛋白提取試劑盒分離各組海馬CA1區組織的膜蛋白，并用BCA法對膜蛋白定量后，分別取50 μg膜蛋白、[3H]-glutamate試劑和DHK試劑用于制作總結合管和非特異性管，并在37 ℃下孵育各管30 min后，將一部分反應液用GF/C玻璃纖維濾膜抽濾并用Hepes緩沖液沖洗濾膜2次；將另一部分反應液加入NaOH溶液(0.3 mol/L)中并室溫反應20 min后，將所得混合溶液滴入GF/C玻璃纖維濾膜中。將上述所有濾膜烘干后，加入2 mL閃爍液并避光孵育過夜，用液體閃爍儀測定放射強度，然后根據scatchard反應曲線計算GLT-1的最大結合量(maximum binding capacity，Bmax)、解離常數(dissociation constant，Kd)和谷氨酸攝取量。

1.2.5 海馬CA1區神經組織中谷氨酸含量的測定：按谷氨酸定量試劑盒步驟，各組分別取0.1 g海馬CA1區組織，用組織裂解液在冰上勻漿，收集勻漿液，并用BCA法進行膜蛋白定量；將勻漿液和反應液混合后，用紫外分光光度計分別記錄波長340 nm處反應20 s和5 min 20 s時的吸光度值A1和A2，計算A2-A1值，并根據標準曲線計算谷氨酸含量(mmol/L)，最后根據蛋白含量換算單位mg蛋白中谷氨酸含量。

1.2.6 尼氏(Nissol)染色檢測尼氏體：取各組腦組織，用石蠟包埋，并切為5 μm厚腦片。腦片經脫蠟和再水化后，用0.1%硫堇溶液常溫染色30 min，然后用顯微鏡觀察并拍照，并在200×鏡下計數海馬CA1區每1 mm×1 mm區域內尼氏體數量。

1.2.7 FJ-C(Fluro-Jade C)染色檢測退化神經元：取各組脫蠟至水后的腦片(30 μm厚)，依次經1% NaOH/80%乙醇溶液和0.06%高錳酸鉀溶液浸泡后，用0.01% FJ-C溶液室溫避光孵育45 min，然后用熒光顯微鏡觀察并拍照，并在200×鏡下計數海馬CA1區每1 mm×1 mm區域內FJ-C陽性染色細胞數量。

1.2.8 NeuN免疫組化染色檢測神經元：取各組脫蠟至水后的腦片(5 μm厚)，用常規免疫組化法孵育NeuN抗體，并在DAB顯色后，用顯微鏡觀察并拍照，并在200×鏡下計數海馬CA1區每1 mm×1 mm區域內NeuN陽性染色細胞數量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 海馬CA1區PI3K/AKT信號活性的變化

與假手術組比較，模型組海馬CA1區PI3K/AKT信號活性明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，OX-A能完全逆轉tGCI造成的海馬CA1區PI3K/AKT信號活性滅活(P<0.05)；而相對OX-A組，PI3K/AKT信號抑制劑LY294002能抑制OX-A對PI3K/AKT信號增強效應(P<0.05)(圖1)。

A,B.expressions of p-PI3K; C, D. the expressions of p-AKT; *P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with OX-A group圖1 海馬CA1區PI3K/AKT信號活性的變化Fig 1 Changes of PI3K/AKT signal activity in hippocampal CA1 n=6)

2.2 海馬CA1區GLP-1表達與功能的變化

與假手術組比較，模型組海馬CA1區GLT-1表達、Bmax值和谷氨酸濃度明顯增加(P<0.05)，Kd值和谷氨酸攝取量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，OX-A能完全或部分逆轉tGCI造成的海馬CA1區的上述指標變化(P<0.05)；而相對OX-A組，LY294002能抑制OX-A對tGCI的效應(P<0.05)(圖2，表1)。

*P<0.05 compared with sham group; #P<0.05 compared with model group; △P<0.05 compared with OX-A group圖2 海馬CA1區GLP-1蛋白表達的變化Fig 2 Changes of GLP-1 protein expression in hippo

表1 海馬CA1區GLP-1功能的變化Table 1 Changes of GLP-1 function in hippocampal CA1 n=6)

2.3 海馬CA1區神經元的病理學改變

與假手術組比較，模型組海馬CA1區尼氏體和NeuN陽性神經元數量明顯降低(P<0.05)，FJ-C陽性神經元數量明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，OX-A能增加海馬CA1區尼氏體和NeuN陽性神經元數量并降低FJ-C陽性神經元數量(P<0.05)；而相對OX-A組，LY294002能抑制OX-A對tGCI的效應(P<0.05)(圖3,表2)。

表2 海馬CA1區尼氏體、NeuN陽性細胞和FJ-C陽性細胞的密度Table 2 Density of Nissl body, NeuN positive cell and FJ-C positive cell in hippocampal CA1

圖3 海馬CA1區神經元的病理學改變Fig 3 Pathological changes of hippocampal CA1 neurons (scale bar=50 μm)

3 討論

IBI是造成全球人類的第一大致殘和第三大致死的重要病因[7]，但目前IBI的治療效果并不太理想[8]。因此，尋找更多有效的IBI治療策略頗為緊迫。

OX-A具有減輕IBI的作用[5,9]，但具體機制尚不完全清楚。興奮性谷氨酸的神經毒性是IBI的重要機制之一[1]。IBI后，海馬CA1區細胞外谷氨酸的清除主要依賴GLT-1將細胞外谷氨酸攝取到膠質細胞內[2]。在大鼠tGCI模型中，在海馬CA1錐體層發生遲發性神經元死亡(delayed neuronal death，DND)之前，就觀測到CA1星形膠質細胞GLT-1的表達和谷氨酸轉運蛋白電流的最大幅度的降低[10]，本研究同樣觀測到在tGCI大鼠海馬CA1區GLT-1表達降低和DND。在缺氧環境下，OX-A能通過增加GLT-1的表達促進體外膠質細胞對谷氨酸的攝取能力[11]，這可能是OX-A抗IBI的機制之一。而OX-A對大鼠tGCI模型中海馬CA1區GLT-1表達和功能的影響尚不清楚，本研究結果顯示，OX-A能增加海馬CA1區GLT-1的表達和最大結合量，并促進GLT-1對谷氨酸的親和力和攝取能力，減少了興奮性谷氨酸在細胞外水平，最終減少了DND。

在糖氧剝奪條件下，星形膠質細胞的PI3K/AKT信號活性降低；而增強PI3K/Akt信號活性可上調星形膠質細胞的GLT-1的表達并增強其攝取細胞外谷氨酸的能力[12]，這一結果提示GLT-1的表達受到PI3K/AKT信號活性調節。OX-A降低MCAO大鼠的腦梗死體積的作用與其激活PI3K/AKT信號活性相關[5]。本研究結果顯示，大鼠tGCI后海馬CA1區PI3K/AKT活性降低和GLP-1表達、結合與攝取功能下降相一致；給予OX-A治療后PI3K/AKT活性增強和GLP-1表達、結合與攝取功能增高相一致，這一結果說明，在大鼠tGCI模型中，OX-A對GLP-1表達與功能的促進作用與其上調PI3K/AKT活性相關。此外，本研究還通過側腦室注射PI3K/AKT抑制劑LY294002的方法進一步證實了OX-A通過上調PI3K/AKT活性來發揮促進GLP-1表達、結合與攝取谷氨酸功能以及減輕DND的作用。

綜上所述，外源性OX-A可通過上調PI3K/AKT信號活性來增加tGCI大鼠海馬CA1區GLT-1表達、增強與GLP-1結合和攝取谷氨酸的功能并減輕興奮性谷氨酸導致的DND。