剪接因子MBNL3對胰腺癌細胞惡性生物學行為的影響

郝文真，陳杰民，馮云路，吳 晰，王 強，吳 東，楊愛明

(中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 疑難重癥及罕見病國家重點實驗室 消化內科，北京 100730)

胰腺癌(pancreatic caner)的治療效果差、病死率高，預計到2030年，它將成為繼肺癌之后第二大癌相關死亡原因[1]。由于早期缺乏特異臨床癥狀和合適的診斷方法，只有20%胰腺癌在進行相關檢查時得以診斷[2]。胰腺癌治療的耐藥性也是難以解決的問題[3]。因此，探索胰腺癌發生發展機制，為尋找胰腺癌早期診斷和治療靶點提供理論基礎非常重要?？勺兗艚釉谏磉^程中發揮重要作用，剪接失調是腫瘤發生的特征之一。肌盲樣蛋白(muscleblind-like proteins，MBNL)是一種RNA結合蛋白，可雙向調節剪接過程[4]，在癌組織中過表達可能促進細胞增殖，抑制細胞凋亡[5]。本研究擬探討MBNL3在胰腺癌組織中表達情況，同時利用體外培養技術敲低或過表達胰腺癌細胞系中的MBNL3基因，觀察癌細胞生物學行為和功能的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例來源：納入2017年至2020年于北京協和醫院行胰腺癌切除的50例胰腺癌患者，獲取胰腺癌組織及對應癌旁胰腺組織(距離腫瘤病灶邊緣>5 cm)石蠟樣本。納入標準：腫瘤局限于胰腺實質內，無胰腺外侵襲及淋巴結轉移，術后病理明確診斷為胰腺癌；術前未接受過放射治療和(或)化學治療；排除胰腺細胞不典型增生患者。該研究通過北京協和醫院倫理委員會審核批準并豁免知情同意書(倫理審查批件編號：ZS-2698)。

1.1.2 細胞系及主要試劑：人正常胰腺導管上皮細胞系HPDE、人胰腺癌細胞系ASPC1、BXPC3、CFPAC1和SW1990(中國科學院上海分院細胞庫)；RPMI 1640培養基(貨號21870076)、胰蛋白酶(貨號:15050065)、胎牛血清(貨號:10099141)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白定量試劑盒(貨號:23227)、細胞裂解液(貨號:89900)(Thermo Fisher Scientific公司)；蛋白酶抑制劑(貨號:ab65621)、兔抗人MBNL3抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體(Abcam公司)；Neofect DNA轉染試劑(貨號:TF201201)(北京瑪因科技有限公司)；免疫組織化學檢驗試劑盒(貨號:GK500705)(Dako公司)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)法：按照試劑盒說明書操作，微波熱修復抗原10 min后等待溫度自然降至室溫，DAB顯色90 s。每張切片免疫組化結果均由2位病理科醫師雙盲評價。根據免疫組化染色著色強度和范圍綜合評價：1)細胞無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；2)無陽性細胞為0分，陽性腫瘤細胞數占腫瘤細胞總數百分比<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。將這兩項評分的乘積作為最終評分，包括0、1、2、3、4、6、9分。

1.2.2 蛋白質印跡實驗：當胰腺癌細胞匯合度達80%時，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液(1∶200)，充分裂解后，BCA試劑盒定量變性。蛋白行10% SDS-PAGE。轉膜后脫脂奶粉封閉過夜。一抗4 ℃搖床孵育8 h，二抗室溫孵育1 h。PBST洗滌后暗室顯影，用Image J軟件灰度分析蛋白條帶。

1.2.3 載體構建與質粒轉染：質粒構建與測序鑒定由上海吉瑪制藥技術有限公司完成。以pcDNA3.1質粒為骨架，攜帶啟動子、新霉素抗性基因、氨芐霉素抗性基因，在HindⅢ和BamHⅠ兩處酶切位點剪切后插入人MBNL3基因，構建過表達質粒CMV-HindⅢ-MBNL3-Flag-BamHⅠ和敲低質粒CMV-HindⅢ-shRNA1-MBNL3-BamHⅠ及CMV-HindⅢ-shRNA2-MBNL3-BamHⅠ。采用質粒轉染技術，在MBNL3表達水平較高的胰腺癌野生型細胞系ASPC1和SW1990中選擇兩個位點敲低MBNL3基因表達，在MBNL3表達水平較低的胰腺癌野生型細胞系BXPC3和CFPAC1中過表達MBNL3基因。采用Neofact轉染法按照說明書配制體系，將shRNA-control、shRNA1-MBNL3、shRNA2-MBNL3、pcDNA3.1-Flag和MBNL3-Flag分別轉染至上述4種胰腺癌細胞系中。

1.2.4 細胞增殖實驗：E-Plate檢測板使用前用紫外線照射過夜并調零。轉染后，細胞計數以3 000個/孔接種于E-Plate檢測板，實時無標記動態細胞分析技術(real-time cellular analysis,RTCA)法觀察比較各組細胞增殖情況。

1.2.5 平板集落形成實驗：轉染后的細胞以每孔1 000個/3 mL接種于6孔板。于5% CO2、37 ℃培養10 d后，甲醇固定，結晶紫染色。拍照保存并計數每孔細胞集落形成數目。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲：在Transwell小室濾膜上鋪2%基質膠100 μL，用于侵襲實驗。遷移實驗Transwell小室濾膜不鋪膠。當細胞匯合度達80%時，用無血清培養基重懸配制成6×105/mL細胞懸液。下室加含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基800 μL，上室加細胞懸液100 μL。于5% CO2、37 ℃培養10 h后，甲醇固定，結晶紫染色。普通光學顯微鏡下觀察細胞遷移和侵襲結果。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 MBNL3蛋白在胰腺癌細胞系和組織中的表達

在正常胰腺導管上皮細胞系HPDE和4種胰腺癌細胞系ASPC1、BXPC3、CFPAC1、SW1990中，正常胰腺導管上皮細胞HPDE中無表達，胰腺癌細胞系ASPC1和SW1990中的表達量高于BXPC3和CFPAC1(圖1A)。

MBNL3蛋白在胰腺癌組織著色強度和著色范圍評分分別為2.8±0.3和2.5±0.6，均顯著高于其所對應癌旁組織的1.1±0.6和1.0±0.6(P<0.05)；50例胰腺癌組織中，MBNL3的免疫組化染色評分為5.0±2.7，顯著低于癌旁組織的2.1±0.6(P<0.05)(圖1B)。

A.protein expression of MBNL3 in pancreatic normal or cancer cell lines; B.protein expression of MBNL3 in pancreatic cancer tissues and adjacent tissues(×20); *P<0.05 compared with adjacent tissue group圖1 MBNL3在正常胰腺上皮細胞系和胰腺癌細胞系、組織中的表達Fig 1 Protein expression of MBNL3 in pancreatic normal or cancer cell lines and pancreatic cancer n=3)

2.2 MBNL3對胰腺癌細胞增殖、遷移、侵襲與集落形成的影響

2.2.1 轉染后胰腺癌細胞系MBNL3蛋白表達：蛋白印跡法結果顯示，與野生型細胞相比，敲低的ASPC1和SW1990細胞中MBNL3蛋白表達水平顯著下調(P<0.05)，而過表達的BXPC3和CFPAC1細胞中MBNL3蛋白表達水平顯著上調(P<0.05)(圖2A)。

2.2.2 對胰腺癌細胞增殖能力的影響：與對照組相比，72 h內過表達組的胰腺癌細胞增殖曲線高于對照組，而敲低組的胰腺癌細胞增殖曲線低于對照組(圖2B)。

A.protein expression of MBNL3 in transfected pancreatic cancer cell lines; B.effects of MBNL3 on proliferation of pancreatic cancer cell lines; *P<0.05 compared with control group圖2 轉染后胰腺癌細胞系MBNL3表達與增殖Fig 2 Expression of MBNL3 and cell proliferation in transfected pancreatic cancer cell n=3)

2.2.3 對胰腺癌細胞集落形成能力的影響：轉染10 d后，過表達組的胰腺癌細胞集落形成體積大，集落數目多(P<0.05)；而敲低組的胰腺癌細胞集落形成體積小，集落數目少(P<0.05)(圖3A)。

2.2.4 對胰腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響：與對照組相比，過表達組的胰腺癌細胞穿過Transwell小室膜的數量更多(P<0.05)；而敲低組的胰腺癌細胞穿過Transwell小室膜的數量更少(P<0.05)(圖3B,C)。

A.images of MBNL3 knocked down or over-expressed on colony formation of pancreatic cancer cell lines; B.effects of MBNL3 knocked down or over-expressed on migration capacity of pancreatic cancer cells by Transwell assay(×20); C.effects of MBNL3 knocked down or over-expressed on invasion capacity of ASPC1 pancreatic cancer cells by Transwell assay(×20); *P<0.05 compared with control group圖3 轉染后胰腺癌細胞系集落形成、遷移和侵襲Fig 3 Colony farming, migration and invasion of transfected pancreatic cancer cell n=3)

2.2.5 繪制ROC曲線:根據MBNL3在胰腺癌組織中表達的免疫組化染色總分來繪制ROC曲線，結果提示，以免疫組化總分為預測指標，當得分為3時，曲線下面積最大為0.88，約登指數為0.56(圖4)。

圖4 基于MBNL3在胰腺癌組織中免疫組化得分的ROC曲線Fig 4 ROC curve based on Immunohistochemistry Score of MBNL3 in pancreatic cancer tissue

3 討論

MBNL3通過直接或參與調節可變剪接的蛋白質，如替代外顯子編碼序列[6]、鋅指結構[7]、富蛋白元素[8]、下游富含谷氨酰胺區域[9]等調節可變剪接過程，對組織胚胎發育至關重要，表達異常會引起疾病[10]。

本實驗結果提示MBNL3過表達可能與胰腺癌發生、發展有密切關系。MBNL3對癌細胞的促進作用在肝細胞肝癌中也有報道[11]。TCGA數據庫分析表明，MBNL3表達水平在胰腺癌與正常胰腺組織存在差異，分化差的胰腺癌中其表達水平更高。本研究的MBNL3免疫組化胰腺癌ROC曲線提示，當得分為3時，區別胰腺癌組織與癌旁胰腺組織能力最優，得分高于3時診斷傾向于胰腺癌。有研究對683例胰腺癌血清CEA和CA12-5分析并制作ROC曲線，二者區別胰腺癌的曲線下面積分別為0.89和0.85[12]。另外，數據庫分析顯示MBNL3過表達對患者無病生存期和總生存期有影響，提示MBNL3有可能作為胰腺癌診斷和預后的潛在生物分子標志物。

本研究納入的胰腺癌臨床病理樣本不伴周圍侵襲、沒有淋巴結與遠處轉移，發現MBNL3蛋白表達水平與胰腺癌惡性生物學行為有密切關系，初步表明MBNL3有可能作為胰腺癌早期診斷或生物治療的分子標志物。本研究的不足之處是納入樣本較少，仍需要大批量組織樣本進行驗證。有望通過血清學檢測來探究MBNL3在早期診斷和預后檢測中的診斷效能和應用價值。

總之，本研究初步揭示了MBNL3在促進胰腺癌細胞侵襲和轉移中的作用。有關MBNL蛋白家族的研究對尋找胰腺癌早期診斷和生物治療提供新的分子靶標具有重要意義。