原花青素抑制Aβ25-35誘導的人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y分泌Aβ1-42

李 琪，張小強*，陶一凡，朱孟雯，崔丹丹，孫騰騰

(東南大學 1.公共衛生學院； 2.環境醫學工程教育部重點實驗室， 江蘇 南京 210009)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以細胞外β淀粉樣斑塊沉積、細胞內神經原纖維纏繞形成以及神經細胞死亡為病理特征的神經退行性疾病[1]。阿爾茨海默病患病人數的急劇上升給經濟帶來巨大負擔，預防和控制阿爾茨海默病有重要意義。

Wnt信號通路對細胞增殖、分化、凋亡及細胞極性、腫瘤細胞的遷移和侵襲都有影響，經典Wnt信號通路在維持神經系統和神經元發育中起著重要作用[2-4]。大量研究顯示Wnt/β-catenin信號通路的失調在AD多種病因中發揮作用[5-6]。

原花青素(proanthocyanidins, PC)是一種具有抗炎、抗氧化，能夠減緩衰老的多酚類物質，對神經損傷有顯著的保護作用[1, 7-8]。關于PC對神經系統疾病保護作用的機制尚未完全闡明。本研究以β淀粉樣肽(amyloid-β peptide，Aβ)Aβ25-35誘導SH-SY5Y細胞，探究PC對糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)、β-連接蛋白(β-catenin)以及Aβ1-42表達水平的影響，并觀察應用Wnt/β-catenin信號通路內源性阻斷劑Dickkopf-1(Dkk1)后各指標的變化情況，旨在為拓展PC應用領域，預防阿爾茨海默病提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y(中國典型培養物保藏中心)。

1.1.2 藥品及主要試劑：原花青素(純度>95%)(上海阿拉丁生化科技有限公司)；Aβ25-35(純度>99%)(ApexBio公司)；重組人Dkk1(Peprotech公司)；DMEM高糖培養基(Hyclone公司)；胎牛血清(ClarkBio公司)；MTT試劑(Sigma-Aldrich公司)；BCA蛋白濃度試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；人淀粉樣肽(Aβ1-42)ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)；β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β抗體和二抗m-IgGκ BP-HRP(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養及分組處理：將SH-SY5Y細胞培養于含10%胎牛血清、1%青霉素與鏈霉素的DMEM完全培養基中，置于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中孵育，當細胞匯合度達到80%～90%時進行傳代。分為空白組、對照組、Aβ25-35組(1、5、15、20、25 μmol/L)、原花青素組(0.1、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/mL)、原花青素(1.0、2.5、5.0、7.5、10.0 μg/mL)+Aβ25-35(15.0 μmol/L)組、Dkk1(100 ng/mL)組和Dkk1(100.0 ng/mL)+原花青素(7.5 μg/mL)+Aβ25-35(15.0 μmol/L)組。

1.2.2 MTT法檢測細胞活力：將SH-SY5Y細胞以1×104個/mL的濃度接種于96孔板，每孔100 μL。測定原花青素對Aβ25-35染毒的SH-SY5Y細胞活力的影響時，原花青素干預組加入含Aβ25-35培養液預處理2 h，更換含原花青素培養液繼續培養24 h。MTT法檢測細胞活力。用酶標儀在波長492 nm處測定吸光度(A值)，計算各組細胞活力。

1.2.3 Western blot 檢測相關蛋白表達：將SH-SY5Y細胞以1×104個/mL的濃度接種于6孔板中，每孔2 mL。Dkk1提前1 h加入，其他干預液添加同1.2.2。用添加蛋白酶抑制劑混合物的RIPA裂解液提取蛋白，冰浴操作，BCA法定量蛋白濃度。取適量蛋白進行凝膠電泳分離、轉膜、封閉，分別以β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后二抗m-IgGκ BP-HRP室溫孵育2 h，再次洗膜，加超敏ECL化學發光試劑顯影，用Image J軟件分析吸光度值。

1.2.4 ELISA檢測Aβ1-42的表達：將SH-SY5Y細胞以濃度為1×104個/mL接種于12孔板中，每孔1 mL。收集細胞上清液于滅菌離心管中，4 ℃，3 000 r/min離心15 min，收集上清，按照ELISA試劑盒說明書操作，用酶標儀在波長450 nm處測定吸光度(A)值，根據標準曲線計算Aβ1-42表達水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 PC對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞活力及Aβ1-42分泌水平的影響

與對照組相比，實驗劑量的PC對細胞增殖無明顯影響(圖1A)。與對照組相比，15、20、25 μmol/L的Aβ25-35使細胞活力降低(P<0.05)(圖1B)。與15 μmol/L Aβ25-35組相比，PC干預24 h后細胞活力升高(P<0.05)(圖1C)。

與對照組相比，用15 μmol/LAβ25-35誘導細胞后，Aβ1-42的分泌水平升高(P<0.05)；以不同濃度PC干預，Aβ1-42的分泌水平降低(P<0.05)。在一定劑量范圍內，PC干預可降低Aβ1-42表達水平并呈現劑量-效應關系(r=0.990，P<0.05)(圖1D)。

A-C.effects of PC, Aβ25-35 or PC+Aβ25-35 on cell viability; D.secreted Aβ1-42 was measured by ELISA; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Aβ25-35 group圖1 PC和(或)Aβ25-35對SH-SY5Y細胞活力及Aβ1-42分泌水平的影響Fig 1 Effects of PC and (or) Aβ25-35 on the cell viability or the secreted Aβ1-42 in SH-SY5Y n=3)

2.2 PC對Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達水平的影響

與對照組相比，15 μmol/L Aβ25-35處理后，細胞中β-catenin蛋白及p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達水平降低(P<0.05)。用不同濃度PC干預后，細胞中β-catenin蛋白及p-GSK-3β(Ser9)蛋白的表達水平升高(P<0.05)。在一定劑量范圍內，PC干預可提高β-catenin蛋白的表達水平并呈現劑量-效應關系(r=0.932，P<0.05)(圖2)。

A.Western blot analysis of the β-catenin、GSK-3β or p-GSK-3β(Ser9) protein levels; B,C.effects of PC on β-catenin or p-GSK-3β(Ser9)protein expressions; *P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with Aβ25-35 group圖2 PC干預對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞β-catenin和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達的影響Fig 2 Effects of PC on β-catenin or p-GSK-3β(Ser9) protein expressions in SH-SY5Y cells induced

2.3 PC通過Wnt/β-catenin信號通路降低Aβ1-42的分泌

與對照組相比，Aβ25-35組和Dkk1組β-catenin蛋白和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達水平下降(P<0.05)，細胞分泌的Aβ1-42增多(P<0.05)。預先加入Dkk1后，與Aβ25-35+PC組相比，細胞中β-catenin蛋白和p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達水平下降(P<0.05)，Aβ1-42分泌增多(P<0.05)(圖3)。

A.Western blot analysis of the β-catenin、GSK-3β or p-GSK-3β(Ser9) protein levels；B,C. effects of PC on β-catenin or p-GSK-3β(Ser9) protein expressions；D.secreted Aβ1-42 was measured by ELISA; *P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with Aβ25-35 +PC group圖3 PC通過Wnt/β-catenin信號通路降低Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞Aβ1-42的分泌Fig 3 Effects of PC on the regulation of the secreted Aβ1-42 through Wnt/β-catenin signaling pathway in SH-SY5Y cells induced by n=3)

3 討論

Wnt信號通路在神經系統發育期間就開始發揮功能，并影響成人大腦中的突觸可塑性，該途徑在預防神經退行性疾病中有重要意義[2]。激活Wnt/β-catenin信號通路可以降低神經炎性反應的發生，減少抑郁行為的出現，阻止小膠質細胞活化等，該作用與GSK-3β抑制以及β-catenin積累有關[6]。

p-GSK-3β(Ser9)作為GSK-3β蛋白磷酸化的抑制性位點，可抑制GSK-3β表達[9]。本研究結果顯示，在一定劑量范圍內，應用PC可逆轉Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞中p-GSK-3β(Ser9)蛋白表達下降，提高其介導的GSK-3β抑制作用。GSK-3β作為Wnt/β-catenin信號通路的負調節因子，可參與氧化應激、炎性反應、細胞凋亡等大量分子和細胞功能的調節[10]。GSK-3β激活通過調節APP的裂解參與AD腦中Aβ的形成和積累，GSK-3β更是確定的tau蛋白主要激酶[11]。

同時，實驗結果還顯示，PC干預還可改善Aβ25-35誘導所致細胞β-catenin蛋白表達水平的降低。因此，β-catenin可以看做是Wnt信號傳導的下游效應器。在N2a細胞中，促進β-catenin與TCF4結合可抑制BACE1表達，降低Aβ濃度[12]。Wnt/β-catenin信號功能障礙時，在小鼠或者離體細胞水平細胞內Aβ1-40和Aβ1-42的含量會上升[13]。Aβ沉積和tau蛋白過度磷酸化是阿爾茨海默病的重要病理改變。Wnt/β-catenin信號通路有可能是未來預防和治療阿爾茨海默病治療中的重要靶點。

本研究結果顯示，給予PC干預后，能明顯降低Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞中Aβ1-42分泌。預先加入Wnt/β-catenin信號通路抑制劑Dkk1后，再用原花青素干預Aβ25-35誘導的細胞，細胞中β-catenin、p-GSK-3β(Ser9)的分泌水平較未加入Dkk1組均降低，而Aβ1-42分泌水平上升。說明PC對細胞的保護作用降低，PC可能通過Wnt/β-catenin信號通路發揮對Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞損傷的保護作用。

綜上所述，PC可抑制Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞Aβ1-42生成，該作用可能與Wnt/β-catenin信號通路有關。本實驗結果可為以Wnt/β-catenin信號通路為靶點開發阿爾茨海默病新藥物提供實驗依據，也為拓展PC應用范圍，開發PC新功效提供新思路。