全血鐵和銅與心血管疾病關聯的基于隊列的病例對照研究

黃 仙，吳壽嶺，陳朔華，孫園園，張 迪，郭淑霞*，王 麗*

(1.石河子大學 醫學院 預防醫學系，新疆 石河子 832000；2.中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院基礎學院 流行病與衛生統計學系，北京 100005；3.開灤總醫院 心內科，河北 唐山 063000； 4.開灤(集團)公司 員工健康保障中心，河北 唐山 063000)

心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是導致包括中國在內的全球死亡的首要原因[1]?？刂艭VD的危險因素，尤其是可控的危險因素，從而最終實現CVD的預防和控制是中國乃至全球面臨的重要公共衛生問題之一。目前已確定的CVD危險因素包括高血壓、高血脂、吸煙、肥胖及糖尿病等[2-3]。近年來，微量元素對心血管健康的影響逐漸被關注。研究顯示，人體微量元素的不平衡可能導致CVD的發生風險增加，但結論仍然存在不一致[4]。因此，本研究擬基于開灤隊列人群開展病例-對照研究，探討全血鐵、銅及其交互作用與CVD的發生風險關聯。

1 材料與方法

1.1 研究對象

本研究是以開灤隊列人群為基礎的病例對照研究(cohort-based case control study)。開灤隊列始建立于2006年，以河北省開灤集團所轄的11家醫院的所有職工體檢人群為研究對象，每兩年隨訪一次。本研究病例選自2017-08-01至2018-05-31，在該集團所轄的林西醫院、馬家溝醫院和荊各莊醫院3家醫院隨訪，且經診斷為CVD的93例男性；其中CVD的診斷標準分別遵循美國心臟病學院和美國心臟協會(ACC/AHA)2009年修訂的心肌梗死治療指南[5]和1989年世界衛生組織(WHO)針對卒中提出的標準診斷[6]。對照組選自同期相同醫院隨訪的無CVD男性，與病例組按照年齡(±5歲)和職業(體力勞動、腦力勞動)進行1∶4的個體匹配，共372名對照。本研究排除了受微量元素潛在影響的疾病，如癌和帕金森病。本研究已經通過開灤集團有限公司醫院醫學倫理委員會批準；此研究經開灤集團和中國醫學科學院倫理委員會批準(批準號：2018ZX10715005)，并取得所有涉及此項研究對象的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集及指標測量：由統一培訓的醫生和護士按照統一的標準，通過問卷調查、體格檢查和實驗室檢查收集信息。問卷調查包括年齡、性別、職業、吸煙、飲酒史、病史(高血壓、糖尿病等)等。體格檢查包括身高、體質量、腰圍、臀圍和血壓等的測量，并根據體質量(kg)/身高2(m2)計算體質指數(body mass index, BMI)。 常規實驗室檢查包括血生化(血紅蛋白等)和血常規(三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖和高敏C反應蛋白等)。所有受檢者收集靜脈血標本前均空腹≥8 h，采用日立7600自動化分析儀測定血常規和血生化指標。同時采用電感耦合等離子質譜儀分析方法檢測全血中鐵和銅含量，具體的方法為：全血樣品經0.5%硝酸稀釋、混勻、離心后，取上清液，再次經0.5%硝酸稀釋、混勻，作為待測溶液樣品。分別取銅和鐵標準品，以0.5%硝酸逐級稀釋為工作標準溶液。將工作標準溶液系列樣品和待測溶液樣品依次上機，同時加入內標混合溶液，建立內標校正標準曲線法以定量分析血鐵和血銅濃度。采用混合人全血樣品作為質控樣品，跟隨每個批次進行檢測。

1.2.2 相關變量的定義以及診斷標準：吸煙定義為每天至少吸1支煙并且連續吸煙超過1年。飲酒定義為過去一年內至少飲酒12次及以上。高血壓定義為收縮壓≥140 mmHg或舒張壓≥90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，或正在服用高血壓降壓藥物，或自我報告有高血壓患病史[7]。糖尿病定義為空腹血糖≥7.0 mmol/L，或有降血糖用藥史，或自我報告糖尿病患病史[8]。高血脂癥定義為總膽固醇≥5.2 mmol/L或三酰甘油≥1.70 mmol/L或高密度脂蛋白膽固醇<1.0 mmol/L或低密度脂蛋白膽固醇≥3.4 mmol/L[9]；BMI≥24 kg/m2定義為超重或肥胖[10]；貧血定義為血紅蛋白<130 g/L[11]。

1.3 統計學分析

在探討全血鐵、全血銅與CVD的單獨效應時，首先基于限制性立方樣條函數確定全血鐵和血銅與CVD的關系，并將其作為全血鐵和血銅的分組依據；之后采用3個條件logistic回歸模型分別探討全血鐵和全血銅與CVD之間的風險關聯：模型1校正年齡；模型2校正年齡、吸煙、飲酒、超重；模型3進一步校正高血壓、糖尿病、高血脂癥、貧血和高敏C反應蛋白。

進一步探究全血鐵和血銅共暴露與CVD的效應。首先，將所有金屬濃度進行Z轉換，采用自適應彈性網絡回歸(Adaptive Elastic-net, AENET)模型[12]對全血鐵和血銅的線性項、平方項以及二者的交互項進行篩選，懲罰系數根據5-折交叉驗證法得到，選擇最小預測誤差的參數作為最終納入的懲罰系數；使用AENET模型中保留的與CVD關系密切的金屬項構建環境風險評分(Environmental Risk Score, ERS)代表全血鐵和血銅對CVD的綜合效應。ERS計算公式如下：

所有數據分析均采用SAS9.4版和R3.6.1版軟件完成。

2 結果

2.1 研究人群基本特征

研究對象特征如表1所示，病例組的平均年齡為(61.3±7.9)歲，對照組為(61.0±7.5)歲。與對照組相比，CVD組人群超重、糖尿病、高血壓和貧血的比例以及高敏C反應蛋白水平均偏高(P<0.05)。但兩組人群在吸煙、飲酒和高血脂癥等的分布上無顯著差異無統計學意義。

表1 研究人群特征分布Table 1 Characteristics of the participants

2.2 病例組和對照組人群全血鐵和全血銅濃度的分布

CVD組全血鐵濃度顯著高于對照組[(576.06±103.78)μg/mLvs. (480.60±100.53)μg/mL]，而血銅濃度顯著低于對照人群(0.54±0.10)μg/mLvs. (0.63±0.12)μg/mL(P<0.001)。Spearman 相關分析結果顯示，全血鐵和血銅存在負相關關系(相關系數r=-0.334，P<0.001)(圖1，表1)。

*P<0.01 compared with control圖1 全血鐵和血銅濃度在病例組和對照組人群中的分布Fig 1 Blood iron and copper concentrations in case and control n=93/372)

2.3 全血鐵和血銅與CVD

限制性立方樣條(restricted cubic spline,RCS)回歸分析顯示，全血鐵濃度與CVD呈現正向線性關系(線性檢驗P<0.001)；全血銅濃度與CVD之間呈現反向的非線性關系(非線性檢驗P<0.001)(圖2)。

Knots were placed at the 5th, 35th, 65th and 95th percentiles of the blood metal distribution, and the reference values were set at the median of the control group (blood iron: 490.58 μg/mL; copper:0.605 μg/mL).Models were adjusted for age, smoking, drinking, overweight, hypertension, diabetes, hyperlipidemia, anemia and hs-CRP圖2 全血鐵(A)和血銅(B)與CVD的限制性立方樣條曲線Fig 2 Restricted cubic spline curves for association of blood iron (A), blood copper (B) and cardiovascular diseases

根據樣條圖結果，全血鐵以對照組的中位值(490.58 μg/mL)分為低血鐵組和高血鐵組，全血銅根據對照人群的75分位數(0.684 μg/mL)分為低血銅組和高血銅組，分別構建條件logistic回歸。結果顯示(表2)：對于全血鐵3個模型均表現出高血鐵組人群的CVD發生風險較低血鐵組增加(P<0.001)；而對于全血銅，低血銅組發生CVD的風險較高血銅組增加(P<0.01)。

表2 全血鐵、銅與心血管疾病風險關Table 2 Associations between blood iron, copper and cardiovascular diseases

2.4 全血鐵和血銅危險評分與CVD

全血鐵、銅的線性項、平方項及其交互作用均被保留在AENET模型中(表3)?；谏鲜瞿Ｐ头謩e計算每個病例和對照的環境風險評分ERS， ERS范圍為-2.683～3.608， 中位值為0.081。隨著鐵濃度的增加，ERS值表現為先升高后降低；而ERS值隨銅的濃度增加，則先降低后升高。進一步采用ROC曲線分析ERS與CVD的關系，結果提示當臨界值為0.232時ERS對于CVD的預測價值更好。因此以ERS≤0.232為參照組，分別采用單因素及多因素模型探討ERS評分與CVD的關聯(表4)，結果均提示隨著ERS評分的增加，發生CVD的風險增加。

表3 選擇在自適應彈性網絡回歸的血液金屬預測因子Table 3 Selected blood metal predictors in Adaptive Elastic-net regression*

表4 基于條件logistic回歸的ERS與CVD關聯分析Table 4 Conditional logistic regression analysis of the association between ERS and CVD

3 討論

本研究通過開展以隊列為基礎的病例對照研究，發現較高的鐵儲量和銅缺乏是CVD的獨立風險因素；同時基于AENET模型構建鐵和銅的共暴露評分，發現ERS值越高，CVD的發生風險越高。

1981年，Sullivan提出“鐵假說”，認為隨人體鐵儲量不斷蓄積，CVD的發生風險相應增加[13]。本研究同樣支持這個假說，發現高鐵水平會增加CVD的發生風險。其發生機制與氧化應激有關，即當人體鐵含量較高時，可參與Fenton反應生成大量的氧化自由基，進而誘導動脈粥樣硬化的發生[14]。然而部分研究得到相反的結論[15-16]。中國一項病例對照研究[15]發現，在校正BMI、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病和高血脂癥后，與最低四分位數組比較，最高四分位數者發生CVD的風險減低41%(95%CI: 0.40～0.89)。

本研究還發現銅缺乏可能與CVD的風險增加有關。這與Karis[17]等的研究結果一致。研究表明，銅缺乏會降低SOD水平，導致NO下降及氧化應激的增加[18]。而一項前瞻性隊列研究發現了相反的現象，在校正年齡和性別后，血清銅最高四分位數組CVD的死亡風險是最低組的2.58倍(95%CI: 2.05-3.25)[19]。

考慮到金屬元素之間可能存在較強的相關性，本研究進一步探討了鐵和銅共暴露時對CVD的影響。結果發現二者不僅存在單獨效應，也存在負向交互作用。動物實驗中也證實了二者之間的競爭作用。有研究顯示，高鐵飲食喂養大鼠導致其心臟肥大，貧血，血清和組織中銅水平的降低，而通過補充銅能夠逆轉血清銅和銅藍蛋白的活[20]性。

近年來，ERS作為一種新的檢測工具，充分考慮了多種金屬暴露的單獨作用及潛在的交互作用。本研究利用該方法對鐵和銅共暴露進行了量化，結果顯示CVD的發生風險隨ERS的增加而增加。

本研究具有一定的局限性。首先，本研究是病例對照研究，不能對鐵和銅與CVD之間的關聯進行因果推斷。其次，本研究的參與者均為40歲以上的男性，結論不能外推至女性或年輕男性人群。因此，未來仍需要更多的前瞻性研究探索鐵和銅與CVD之間的關系。