西達本胺聯合干擾素α對人皮膚T細胞淋巴瘤細胞系Hut78的協同作用及其分子機制的研究

谷曉廣，劉永生，續言鳳，李孟曙

蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征屬于皮膚T 細胞淋巴瘤，其中蕈樣肉芽腫是皮膚T 細胞淋巴瘤中最常見的類型[1]。目前的研究顯示，蕈樣肉芽腫和Sézary綜合征的發病機制中腫瘤細胞的不斷擴增主要依賴于對凋亡的抵抗而不是過度的增殖[2]。因此，臨床上進展期的蕈樣肉芽腫患者對主要通過抑制細胞增殖的常規化療的治療方法是高度抵抗的。目前針對蕈樣肉芽腫特別是進展為腫瘤期的患者和惡性程度更高的Sézary 綜合征患者治療方法非常有限，系統性化療的緩解率不高。尋求一種高效的藥物和藥物組合是目前治療蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征的關鍵。西達本胺是具有全新化學結構的選擇性組蛋白去乙?；敢种苿℉DAC-I），其對組蛋白的抑制具有特殊性，只針對第Ⅰ大類組蛋白去乙?；福℉DAC）的亞型-HDAC2 和HDAC3，而上述兩種亞型與腫瘤的發生和腫瘤的進展是高度相關的[3]。干擾素（IFN）-α目前是蕈樣肉芽腫治療的一線治療藥物，特別是針對斑片和斑塊期等早期蕈樣肉芽腫具有非常高效的控制腫瘤進展的作用。即使蕈樣肉芽腫進展至腫瘤期以及惡性程度更高的Sézary 綜合征患者，應用IFN-α也是有效的[4]。本研究通過觀察西達本胺和IFN-α 單獨和聯合應用對蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征相關人皮膚T 細胞淋巴瘤細胞系Hut78 增殖抑制和凋亡的影響，檢測Hut78 細胞凋亡相關基因的表達，探究西達本胺聯合IFN-α 治療蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征的可能分子機制。

1 材料和方法

1.1 材料

Hut78 細 胞 系（ATCC 號：TIB-161），RPMI1640培養基（美國GIBCO 公司），胎牛血清（美國GIBCO公司），MTS（美國Promega 公司），FITC-AnnexinV凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司），cDNA 合成試劑盒（加拿大Fermentas 公司），熒光定量試劑盒power SYBR?Green PCR Master Mix（美 國Applied Biosystems 公司），IFN-α（北京凱因生物技術有限公司），西達本胺（深圳微芯生物科技有限公司，貨號：H20140129）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 Hut78細胞在37℃, 5% CO2孵育箱中培養傳代，培養基為RPMI1640，其中含有10%的胎牛血清和1%的青鏈霉素。

1.2.2 采用細胞增殖檢測法（MTS 法）測定細胞增殖取對數生長期細胞（濃度2×104/ml）培養在每孔含1 ml 培養基6 孔板中。西達本胺設4 個濃度組：0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L，IFN-α 設4 個濃度組：3 000、5 000、10 000、20 000 U/ml，再設一個聯合組：1.2 μmol/L西達本胺聯合10 000 U/ml IFN-α，加入等量培養基作為空白對照組作用于Hut78 細胞24、48、72 h。在各個時間點混勻細胞，然后取100 μl 細胞混懸液加至96 孔板中，并且每個濃度做3 個副孔，每孔中加20 μl 預先配置好的MTS 溶液，37℃孵箱中孵育2 h，96 孔板在分光光度儀中測定490 nm 處的吸光度。以上實驗重復3 次，取平均數。

1.2.3 細胞體外克隆形成能力檢測 使用甲基纖維素培養基（MethoCult CFC，StemCell Technologies）對Hut78細胞的體外克隆形成能力進行分析，CFC可以使單個細胞克隆原位進行增殖，進而形成單細胞克隆細胞群落。分別設3個濃度組：1.2 μmol/L西達本胺組、10 000 U/ml IFN-α組以及聯合組，加入等量培養基作為空白對照組先分別處理Hut78細胞24 h，每個濃度組平皿細胞在顯微鏡下計數103個細胞。將細胞加入CFC中并振蕩，然后應用帶鈍端針頭的注射器將混合好的細胞接種到培養皿中，上述培養皿放置在37℃, 5% CO2點孵育箱中培養14 d，再使用倒置顯微鏡和計數皿計數和評估集落類型。上述實驗重復3次取平均值。

1.2.4 流式細胞儀檢查細胞凋亡 在對數生長期內，計數Hut78 細胞（2 ×104/ml）接種于6 孔板中，每孔1 ml。實驗組分別每孔加入1.2 μmol/L 西達本胺，10 000 U/ml IFN-α，1.2 μmol/L 西達本胺聯合10 000 U/ml IFN-α，每孔10 μl，加入等量培養基作為空白對照組培養24 h。不同濃度組計數5×105個細胞，使用冷的PBS 緩沖液沖洗細胞2 次，將Hut78細胞重新以1×106/ml 的濃度懸浮在結合緩沖液中。將100 μl 細胞懸液轉移到5 ml 試管中，每管中加入5 μl 的FITC 偶聯AnnexinV 和5 μl PI。輕輕混勻細胞，避光孵育15 min。每管中加入結合緩沖液400 μl，在1 h 內用流式細胞儀上機進行檢測。應用FlowJo8.0軟件進行數據分析，統計FITC 陽性細胞的百分率。上述需重復3 次，取其平均值。

表1 凋亡相關基因Fas、FasL、Caspase3、Caspase8、內參GAPDH的引物序列

圖1 西達本胺和IFN-α單獨以及聯合對Hut78細胞體外增殖的影響

1.2.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time PCR）檢測細胞凋亡相關基因mRNA 的表達 1.2 μmol/L西達本胺組，10 000 U/ml IFN-α 組，1.2 μmol/L 西達本胺聯合10 000 U/ml IFN-α 組及加入等量培養基作為空白對照組培養24 h 后，分別計數各組Hut78細胞5×105個，高速離心后棄去上清，然后加入Trizol?Reagent 提取細胞RNA，并逆轉錄為cDNA。再以cDNA 為模板，加入選取的目的基因引物，各引物序列見表1。使用power SYBR?Green PCR Master Mix 試劑盒，運用實時熒光定量PRC 檢測儀進行實時熒光定量PCR，與此同時擴增內參GAPDH基因作為定量PCR 的對照。各目的基因mRNA 的表達值=（目的基因Ct 值-內參基因Ct 值）/內參基因Ct 值×104，每個樣本分別重復3 管，最終結果取平均值，上述實驗結果需重復3 次。

1.3 統計學方法

采用SPSS17.0 軟件，計量資料以（±s）表示，組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），各組間均數比較采用LSD-t檢驗進行兩兩比較，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 西達本胺和IFN-α單獨以及聯合對Hut78細胞體外增殖的影響

由圖1 可見，與空白對照組相比，西達本胺0.3、0.6、1.2、2.4 μmol/L 各濃度組，細胞的增殖速度均出現顯著降低。在3 個時間段24 h，48 h 及72 h 差 異均有統計學意 義（F24h=56.45，F48h=121.74，F72h=301.11，P均＜0.05）。與空白對照組相比，IFN-α 3 000、5 000、10 000 、20 000 U/ml 各濃度組細胞的增殖速度均表現為顯著降低。在3 個時間段24 h，48 h 及72 h 差異均有統計學意義（F24h=21.43，F48h=53.38，F72h=182.71，P均＜0.05）。與空白對照組相比1.2 μmol/L 西達本胺、10 000 U/ml IFN-α、1.2μmol/L 西達本胺聯合10 000 U/ml IFN-α 處理組細胞的增殖速度也均表現為顯著降低。在3 個時間段24 h、48 h 及72 h 差異均有統計學意義（F24h=44.21，F48h=38.32，F72h=51.38，P均＜0.05）。上述結果顯示聯合藥物處理組對Hut78 細胞的增殖抑制作用均比單藥處理組對Hut78 細胞的增殖抑制作用更顯著。

2.2 西達本胺和IFN-α單獨以及聯合對Hut78細胞體外克隆形成能力的影響

通過CFC 檢 測1.2 μmol/L西達本胺、10 000 U/ml IFN-α、1.2 μmol/L 西達本胺聯合10 000 U/ml IFN-α 處理組對Hut78 細胞的體外克隆形成能力，先用1.2 μmol/L 西達本胺、10 000 U/ml IFN-α 以及聯合組分別處理Hut78 細胞24 h，再行細胞計數103接種于CFC 上，14 d 后倒置顯微鏡計數形成的細胞群落。結果顯示，與空白對照組相比，1.2 μmol/L 西達本胺、10 000 U/ml IFN-α、1.2 μmol/L 西達本胺聯合10 000 U/ml IFN-α 處理組Hut78 的體外克隆形成能力明顯降低，其中聯合組對細胞的體外克隆形成能力抑制最明顯，與單藥1.2 μmol/L 西達本胺組、10 000 U/ml IFN-α 組相比差異均具有統計學意義（P＜0.05）（圖2）。

2.3 西達本胺和IFN-α單獨以及聯合對Hut78細胞凋亡的影響

1.2 μmol/L 西達本胺組、10 000 U/ml IFN-α 組、1.2 μmol/L 西達本胺聯合10 000 U/ml IFN-α 處理組的Hut78 細胞凋亡比例均顯著高于空白對照組，差異有統計學意義（P均＜0.05）。藥物聯合組的細胞凋亡比例均高于1.2 μmol/L 西達本胺、10 000 U/ml IFN-α等單藥組，差異有統計學意義（P均＜0.05）（圖3）。

圖2 西達本胺和IFN-α單獨以及聯合對Hut78細胞體外克隆形成能力的影響

圖3 西達本胺和IFN-α單獨以及聯合對Hut78細胞凋亡的影響

2.4 西達本胺和IFN-α單獨以及聯合對Hut78細胞凋亡相關基因的影響

采用1.2 μmol/L 西達本胺、10 000 U/ml IFN-α、1.2μmol/L 西達本胺聯合10 000 U/ml IFN-α 處理Hut78細胞24 h，實時熒光定量PCR 對凋亡相關基因Fas、FasL、Caspase3、Caspase8 的相對表 達 量 進行測量。結果顯示，與空白對照組相比、1.2 μmol/L 西達本胺、10 000 U/ml IFN-α、聯合組Fas、Caspase8、Caspase3 基因相對表達量差異均有統計學意義（P均＜0.05），聯合組Fas、Caspase3、Caspase8 基因相對表達量均高于1.2 μmol/L 西達本胺、10 000 U/ml IFN-α 單藥組相對表達量，差異具有統計學意義（P均＜0.001）。而FasL的相對表達量無明顯變化，各治療組與對照組相比差異無統計學意義（P=0.842）（圖4）。

圖4 西達本胺和IFN-α單獨以及聯合對Hut78細胞凋亡相關基因表達的影響

3 討論

目前表觀遺傳學調控藥物去乙?；敢种苿℉DAC-I）已經成功應用于皮膚T 細胞淋巴瘤，特別是蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征的臨床治療[5]。研究顯示HDAC-I 可以通過多種機制抑制腫瘤的發生和發展，對血管生成相關基因表達的下調和抗血管生成基因的表達的激活，進而負向調節腫瘤血管的生成而實現[6]。第二種機制系通過誘導細胞周期停滯進一步促進細胞凋亡，而這種生物學作用的核心是通過上調染色質中組蛋白的乙?；交罨虮磉_而實現的[7]。目前美國食品藥品監督管理局（FDA）已經批準非選擇性針對HDAC 表觀遺傳的小分子藥物——一種去乙?；敢种苿┓⒅Z他（vorinostat）應用于皮膚T 細胞淋巴瘤的治療。臨床研究表明，口服伏立諾他對其他常規抗腫瘤藥物治療失敗的皮膚T 細胞淋巴瘤患者依然有效[8]。西達本胺是我國本土研究機構自主研發的高選擇性HDAC 抑制劑，其特異性地針對HDAC 的某些亞型，這也是該藥物相對于同類藥物伏立諾他的一大優勢，其主要抑制HDAC2 和HDAC3，而HDAC2 和HDAC3 是與腫瘤發生和發展高度相關的第Ⅰ大類HDAC 亞型。臨床試驗顯示該藥物對皮膚T 細胞淋巴瘤的抗腫瘤活性非常高，且其臨床不良反應輕微[3]。有學者運用西達本胺對非霍奇金淋巴瘤患者進行了Ⅰ期臨床研究，結果顯示大部分患者的部分緩解率達到90%[9]。本研究也顯示不同濃度西達本胺作用Hut78 細胞后，其能明顯抑制Hut78 細胞的增殖，并呈時間和濃度依賴性，西達本胺在誘導細胞凋亡的同時可引起凋亡相關基因Fas、Caspase3、Caspase8表達的升高，推測西達本胺可能通過上調Hut78 細胞表面的Fas表達觸發了細胞的FasL-Fas 細胞凋亡信號通路。

重組人IFN-α 很早就應用于對皮膚T 細胞淋巴瘤的治療[10]。目前在臨床上IFN-α 已經成為治療蕈樣肉芽腫和Sézary 綜合征的一線藥物，對斑片、斑塊、腫瘤期蕈樣肉芽腫以及惡性程度很高的Sézary 綜合征患者均具有很好的治療效果[11]。大量關于IFN-α治療腫瘤作用機制方面的研究顯示，IFN-α 可以通過抑制腫瘤細胞的增殖進而誘導其凋亡達到抗腫瘤的目的[12]。個別研究顯示，IFN-α 和常規化療藥物聯合應用能顯著提高對血液系統惡性腫瘤的抗腫瘤活性[13]。但是目前其對于治療皮膚T 細胞淋巴瘤的具體機制報道還比較少。本研究采用不同濃度組的IFN-α 處理Hut78 細胞，結果顯示IFN-α 對Hut78 細胞的體外增殖具有明顯的抑制作用，伴隨著藥物濃度的不斷遞增，這種抑制作用逐漸增強，這種抑制的趨勢呈現為時間和劑量依賴性。

綜上所述，與單用IFN-α 相比，西達本胺與IFN-α 聯合應用對Hut78 細胞的增殖和克隆形成抑制、凋亡誘導作用更加明顯，并對凋亡相關基因Fas、Caspase3、Caspase8 表達的升高作用均明顯高于單用IFN-α，顯示西達本胺聯合IFN-α 能明顯提高抑制皮膚T 細胞淋巴瘤細胞系Hut78 的生長率，初步揭示了西達本胺抑制皮膚T 細胞淋巴瘤細胞系Hut78生長的可能分子機制。