3D打印瓊脂糖和海藻酸鈉復合水凝膠組織與性能研究

湯桂平，嚴 倩，劉 潔，宋 波，文世峰，史玉升

(華中科技大學 材料成形與模具技術國家重點實驗室，武漢 430074)

人體組織器官缺損或功能衰竭嚴重威脅著人類生命，對于終末期器官衰竭的患者來說，器官移植是最好的辦法，有時也是唯一的治療手段[1]。然而全球范圍內器官供體的極大缺口嚴重地限制了器官移植學科的發展，無法滿足廣大病人的移植需求。組織工程是以重構工程化組織或器官、實現人類或動物缺損以及功能衰竭器官替換為目的，融合了生物材料工程學、醫學和細胞生物學等學科的一種極具治療應用前景的技術[2-4]。作為一門交叉學科，組織工程需要在體外構建接種組織或器官特異性細胞的支架，經體外培養后通過外科手術植入體內，支架在體內逐漸被降解和代謝的同時，封裝的細胞逐漸分化成相應的組織或器官，取代病變或缺損部位[5]，維持人體正常生理功能。由于器官移植存在著疾病傳播風險、異體排斥反應和供體嚴重不足等問題，組織工程成為器官缺損或功能衰竭最有潛力的治療手段，因而引起了人們的廣泛興趣[6]。

近些年對組織工程的研究盡管取得了較大發展，但是仍然面臨許多問題，距離實際的臨床應用還存在較大差距[7]。存在的問題包括缺乏具有合適力學性能、生化性質的生物材料，以及材料普遍較差的成形性能等。用于組織工程支架的生物材料要求具有生物相容性、可降解性和與原組織器官相匹配的力學性能。在多種生物材料中，水凝膠由于具備一定的機械強度和天然生物材料的優勢，能夠很好地在體外模擬細胞外基質的功能，因此制備的組織工程支架在軟組織修復方面取得了良好效果[8-10]。Nguyen等[11]制備了納米原纖化纖維素/藻酸鹽和納米原纖化纖維素/透明質酸，把人源誘導的多能干細胞和經輻照的人軟骨細胞封裝在水凝膠中，并通過生物3D打印技術打印出來。結果顯示，納米原纖化纖維素/透明質酸在打印后改變了細胞表型，并且細胞的增殖率較低。而封裝在納米原纖化纖維素/海藻酸鹽中的細胞能夠保留其表型，且產生了具有Ⅱ型膠原蛋白表達的軟骨組織，細胞數量顯著增加。Yang等[12]比較了純海藻酸鈉凝膠、膠原/海藻酸鈉復合凝膠以及瓊脂糖/海藻酸鈉復合凝膠3D打印軟骨支架的性能。結果表明，相對純海藻酸鈉凝膠，膠原/海藻酸鈉復合凝膠和瓊脂糖/海藻酸鈉復合凝膠制備的支架力學性能均有所改善。且在3種支架中，膠原/海藻酸鈉復合凝膠在促進細胞黏附、加速細胞增殖和增強軟骨特異性基因的表達上具有顯著優勢。Lopez-marcial等[13]比較了Pluronic F-127水凝膠、不同濃度的瓊脂糖以及不同比例的瓊脂糖-海藻酸鈉復合水凝膠作為軟骨組織工程生物材料的性能，包括力學性能、打印性能和細胞活性，結果顯示瓊脂糖/海藻酸鈉復合水凝膠具有較大潛力。

由于海藻酸鹽先天的生物相容性、低細胞毒性、高含水量以及快速凝膠化能力，廣泛應用于生物醫療領域。然而海藻酸鹽的強度較低，無法與人體組織相匹配，限制了其作為組織工程材料的應用[14]。瓊脂糖是一種無毒的天然多糖材料，依靠氫鍵保證結構穩定，物理性能隨溫度變化明顯，冷卻后強度顯著提高。本工作采用瓊脂糖來增強海藻酸鈉水凝膠的機械強度，利用3D打印的方法成形海藻酸鈉/瓊脂糖復合凝膠，并在復合凝膠支架中加入碳酸鈣，得到微觀孔隙以便于細胞的黏附和生長。此外，分析不同比例海藻酸鈉和瓊脂糖復合水凝膠的結構變化，包括官能團、含水量以及微觀形貌等。同時，為了使復合凝膠達到實際應用要求的力學性能，研究不同溫度、不同比例的海藻酸鈉和瓊脂糖復合凝膠壓縮模量的變化。

1 實驗材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻酸鈉(SA)，化學純，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖(A)，99.9%，湖北信康醫藥化工有限公司；無水氯化鈣，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；碳酸鈣，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；去離子水。所有試劑均不做進一步處理。

1.2 復合水凝膠的制備和性能表征

海藻酸鈉、瓊脂糖、無水氯化鈣分別與去離子水混合均勻，配制成5%(質量分數，下同)海藻酸鈉溶液、5%瓊脂糖溶液和2%氯化鈣溶液。把瓊脂糖溶液與海藻酸鈉溶液按體積比1∶0，3∶1，2∶1，3∶2，1∶1，1∶2，0∶1分別混合均勻，并靜置至少2 h。將5%的海藻酸鈉溶液稀釋到0.5%后，使用圓二色譜儀(J-810)測試得到的海藻酸鈉對波長范圍在190～260 nm的電磁波的吸收圖譜。在溫度為25 ℃、pH=7、相對濕度為50%時，使用式(1)[15]計算海藻酸鈉中古洛糖醛酸含量x。

ln(P/T)=-0.00387x+1.1519 (r=0.980)

(1)

式中：P是圓二色光譜中手性分子兩個吸收峰的高度差；T是光譜圖像中穩定值和負峰之間的深度;r為置信度。升高溫度，分別在40，60 ℃和80 ℃測試海藻酸鈉手性分子的含量。

為了測定不同比例海藻酸鈉/瓊脂糖復合凝膠含水量的變化情況，把上述不同比例的復合凝膠與氯化鈣溶液完全交聯后，倒入模具中形成塊體，用去離子水清洗后吸取試樣表面的水分，得到濕重W1，冷凍干燥后，再次稱重記為W2。

復合凝膠的含水量CW為：

CW=[(W1-W2)/W1]×100%

(2)

為了研究海藻酸鈉/瓊脂糖復合凝膠的化學成分變化，將不同比例的復合凝膠材料與氯化鈣交聯后進行冷凍干燥，使用VERTEX 70傅里葉變換顯微紅外光譜儀測試試樣對電磁波的吸收率，波長范圍為500～4000 cm-1。凝膠材料冷凍干燥后進行噴金處理，使用場發射掃描電鏡觀察干燥凝膠表面和斷面微觀形貌，并對樣品特定部位進行點元素分析。在室溫下將5%的海藻酸鈉溶液以及不同比例的海藻酸鈉/瓊脂糖復合凝膠澆入模具，再用氯化鈣溶液完全交聯，使用E1000電子動靜態疲勞試驗機測試其壓縮性能，壓縮速率為10 mm/min。

1.3 3D打印成形

利用本實驗室組裝的直寫打印設備成形復合凝膠，如圖1所示。打印速率為20 mm/s，針嘴內徑為210 μm，每層Z軸上升高度為100 μm，氣壓為482.65 kPa(70 psi)，打印間距為3 mm。

圖1 水凝膠直寫打印示意圖Fig.1 Schematic diagram of printing the hydrogel by direct ink writing

1.4 碳酸鈣對復合凝膠微觀孔隙的影響

把質量比分別為10∶1和5∶1海藻酸鈉與碳酸鈣均勻混合，加入去離子水制備成海藻酸鈉為5%的均勻溶液,然后把這兩種比例的混合溶液與5%的瓊脂糖溶液以海藻酸鈉與瓊脂糖體積比為2∶1的比例均勻混合制成復合凝膠，把這兩種比例的復合凝膠標記為1#和2#凝膠，再把沒有碳酸鈣的海藻酸鈉溶液與瓊脂糖溶液體積比為2∶1的復合凝膠標記為3#凝膠。利用直寫打印成形后，分別浸入氯化鈣溶液完全交聯，經冷凍干燥后噴金處理，使用場發射掃描電鏡分析干燥凝膠表面和斷面微觀形貌。

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉中古洛糖醛酸含量及溫度對結構的影響

海藻酸鈉是一種存在于海藻中的生物聚合物，通常從褐藻中提取出來[16]。其分子由甘露糖醛酸(M段)和古洛糖醛酸(G段)按1→4鍵連接而成，其中G段可與二價陽離子，如鈣離子反應形成三維凝膠網絡。高G段含量的海藻酸鈉與鈣離子交聯后形成的水凝膠硬度和脆性大，而高M段含量海藻酸鈉形成的水凝膠硬度較小，但彈性好。圖2為海藻酸鈉溶液圓二色光譜圖。由圖2(a)可以看出，海藻酸鈉在波長200 nm和212 nm附近分別有一強正吸收峰和負吸收峰，分別表示其內部的兩種手性分子。根據式(1)計算得到海藻酸鈉中古洛糖醛酸含量為47.38%，為高M型海藻酸鈉，交聯后制備的凝膠比高G型彈性更好，更容易產生變形。

從圖2(b)中可以發現，溫度達到60 ℃時，波長為190～195 nm之間時吸收光譜已經發生明顯變化。而當繼續升溫至80 ℃時，海藻酸鈉中甘露糖醛酸對應的正吸收峰明顯降低，說明M段含量已經發生變化，但是古洛糖醛酸對應的負吸收峰并未產生明顯改變。實驗中也發現，當海藻酸鈉溶液加熱至80 ℃以上時，濃度與黏性均明顯降低。

圖2 海藻酸鈉溶液圓二色光譜圖 (a)25 ℃時古洛糖醛酸含量計算原理圖；(b)不同溫度的光譜比較Fig.2 Circular dichroism spectra of sodium alginate solution

2.2 不同比例復合凝膠對含水量的影響

海藻酸鈉與氯化鈣溶液發生離子交聯反應生成海藻酸鈣凝膠，如圖3所示?？梢钥吹?，不同比例的海藻酸鈉/瓊脂糖復合凝膠、純海藻酸鈣水凝膠以及純瓊脂糖水凝膠的含水量差別不明顯，均處于90%左右，能滿足細胞質基質的含水量要求。但與兩種純凝膠相比，復合凝膠的含水量都有所降低，這可能與兩種凝膠復合以后交聯密度增加有關。

圖3 不同體積比的海藻酸鈉與瓊脂糖復合凝膠含水量Fig.3 Water content in sodium alginate and agarose composite hydrogels with different volume ratios

2.3 復合凝膠傅里葉變換紅外光譜分析

圖4 不同比例海藻酸鈉/瓊脂糖復合水凝膠紅外吸收光譜圖

2.4 復合凝膠的形貌表征

使用場發射掃描電鏡和EDS能譜分析研究凝膠微觀形貌和元素組成，并測量斷面中孔隙的大小。圖5～7分別為純海藻酸鈉與氯化鈣溶液交聯后產生的海藻酸鈣、瓊脂糖以及體積比為2∶1的海藻酸鈉/瓊脂糖復合凝膠的微觀形貌和EDS能譜分析，表1為水凝膠的孔隙尺寸?？芍?，圖5(a)中的塊狀和放射狀物質均含有氯化鈉，大量地黏附在海藻酸鈣的表面，從而導致海藻酸鈣表面非常粗糙。而海藻酸鈣的斷面為疏松的層狀組織，組織不致密。由圖6可知，瓊脂糖表面致密、光滑，并分布有亮線。EDS能譜分析可知，亮線部位成分為瓊脂糖。斷面為多孔的不規則層片狀結構，孔徑大小差別很大。

表1 水凝膠的孔隙尺寸

圖6 瓊脂糖掃描電鏡圖及EDS能譜分析

圖5 海藻酸鈣掃描電鏡圖及EDS能譜分析

海藻酸鈉與瓊脂糖的體積比為1∶2時，試樣表面與瓊脂糖凝膠類似，比較光滑。斷面類似于海藻酸鈣，為絲狀結構，但較海藻酸鈣結構更加致密。當海藻酸鈉與瓊脂糖的體積比為1∶1時，復合凝膠表面形貌接近海藻酸鈣樣品，其表面布滿氯化鈉顆粒。斷面也與海藻酸鈣樣品非常相似，但相對其他試樣，其斷面孔徑尺寸較均勻。當海藻酸鈉與瓊脂糖的體積比為2∶1時(圖7)，復合凝膠的表面比較粗糙，并且有較多放射狀物質，其斷面類似于海藻酸鈣，為層片狀結構，且附著有大量顆粒物。通過EDS能譜分析可知，試樣骨架上含有大量Ca和Cl，表面放射狀物質和斷面的多孔層狀結構表面附著的顆粒物為氯化鈉。當海藻酸鈉與瓊脂糖的體積比增加至3∶1時，在試樣表面發現團聚物，元素中不含有C，而Ca和O含量較高，與體積比為1∶2時復合凝膠表面的亮線部位成分相近，說明復合凝膠與氯化鈣反應后會產生氧化物，斷面也為多孔的片狀組織。

圖7 體積比為2∶1的海藻酸鈉/瓊脂糖復合凝膠掃描電鏡圖及EDS能譜分析

從以上測試結果可以發現，除了純瓊脂糖凝膠和體積比為1∶2的復合凝膠外，其他復合凝膠的表面和斷面均比較粗糙，說明瓊脂糖會使復合凝膠變得光滑，因此，瓊脂糖的添加量不宜過多。不同比例的復合凝膠上均附著有氯化鈉或氯化鈣等顆粒，這些顆粒使復合凝膠變得非常粗糙，有利于細胞的黏附。

2.5 復合水凝膠的力學性能

用作植入物的組織支架必須要有足夠的力學性能，以維持其物理完整性，甚至承受一定的負載[17]。海藻酸鈉凝膠及其他用于組織工程的海藻酸鈉復合凝膠彈性模量均較低[12,18-20]，一般不足0.3 MPa。研究表明，水凝膠的模量跟交聯密度、交聯劑類型、聚合物成分和分子量分布有關[21]。

圖8為不同體積比海藻酸鈉/瓊脂糖復合水凝膠的壓縮模量圖?？芍?，5%的純海藻酸鈉水凝膠的壓縮模量為0.339 MPa。加入瓊脂糖以后，大部分復合凝膠的壓縮模量都在一定程度上出現下降，但體積比為2∶1的海藻酸鈉/瓊脂糖復合凝膠逆勢上升，超過純海藻酸鈉，達到了0.353 MPa。由前述可知，加入瓊脂糖以后的復合凝膠含水量有所下降，可能是因為交聯度的增加導致模量上升。而根據電鏡圖可知海藻酸鈉斷面是一種疏松的片狀組織，加入少量低濃度的瓊脂糖后可能有兩種影響：1)相對致密的瓊脂糖組織填補在海藻酸鈉的間隙中與之結合，并發生官能團反應，從而提高了復合凝膠的力學性能；2)瓊脂糖與海藻酸鈉混合后，兩種凝膠的連續性遭到破壞，界面結合效果差，反而降低了力學性能。復合凝膠的力學性能是這幾種因素綜合作用的結果。體積比為2∶1的海藻酸鈉/瓊脂糖復合凝膠逆勢上升，可能是因為交聯度增加和官能團反應因素占了主導作用。

圖8 不同體積比海藻酸鈉/瓊脂糖復合水凝膠的壓縮模量Fig.8 Compression modulus of sodium alginate/agarose composite hydrogels with different volume ratios

直寫打印技術通過計算機實體幾何建模，精確堆積材料，快速制造出任意復雜形狀部件，可以滿足組織工程支架高孔隙率、精確控制孔結構、外形自由設計等個性化定制要求。通過調節擠出成形工藝參數，打印出具有一定形狀的水凝膠支架。

打印所使用的材料是海藻酸鈉/瓊脂糖體積比為2∶1的復合水凝膠。影響打印成形效果的因素主要有材料本身的流變性能、黏度，以及針管直徑、氣壓、打印間距等打印工藝。由于復合凝膠比純海藻酸鈉溶液黏度低，在使用相同大小的針管直徑條件下，用較小壓強就能被擠出。在單層打印實驗中發現，壓強越大，擠出的凝膠單條直徑越大，而針管移動的速度對擠出成形效果無顯著影響。

在多層打印實驗中發現，隨著打印層數的增加，由于不能及時固化，凝膠會在重力作用下出現塌陷現象，實際的材料疊加高度比設計低，因此在打印時需要選擇合適的Z軸上升高度。由于含有瓊脂糖，復合凝膠支架不需要鈣離子就已經凝固，而純海藻酸鈉溶液需要噴灑氯化鈣溶液才能固化。如圖9所示，其他條件相同，僅改變針嘴直徑打印了復合凝膠支架，支架均保持了較好的形狀和尺寸精度。

圖9 不同直徑的針嘴3D打印成形復合水凝膠支架 (a)340 μm；(b)250 μm；(c)210 μmFig.9 Composite hydrogel scaffolds formed by 3D printing with different diameter nozzles

2.6 3D打印復合凝膠支架微觀孔隙

組織工程支架不但對材料的性能和形狀尺寸等有要求，而且還要求支架具有一定的孔隙率，增大表面積用以封裝細胞，并為細胞生長繁殖提供空間和必需的營養輸送通道。3D打印可以成形出具有一定孔隙的三維支架，但是這一工藝能成形的空隙過大，一般超過100微米級，無法實現更小孔隙的成形。因此，本工作通過在水凝膠中加入碳酸鈣，使其在酸性環境下產生二氧化碳氣體，從而在復合凝膠中產生所需的微觀孔隙。圖10為不同質量比海藻酸鈉/碳酸鈣復合水凝膠的電鏡表面形貌。如圖10(a)，(b)所示，海藻酸鈉與碳酸鈣質量比為1∶0和10∶1的試樣表面粗糙，而質量比為5∶1的試樣(圖10(c))表面相對光滑。放大倍數增加到1000倍時，可以看到質量比為10∶1的試樣表面存在絲狀物質，相互纏結，而質量比為1∶0和5∶1的試樣均無絲狀結構。此外，通過高倍電鏡圖可以看到質量比為1∶0和10∶1的試樣存在坑洞或者凹陷，而質量比為5∶1的試樣在100倍和1000倍電鏡下表面均沒有明顯凹陷。

圖10 不同質量比海藻酸鈉/碳酸鈣復合水凝膠的表面形貌

圖11為不同質量比海藻酸鈉/碳酸鈣復合水凝膠的斷面形貌。使用電鏡觀察支架斷面時發現，3種質量比的試樣斷面均比較粗糙。由圖11(b)，(c)可知，10∶1和5∶1的斷面有明顯孔隙，孔徑在微米至亞微米級。在10∶1的試樣斷面上可以清晰地觀察到支架內部有大量的網狀結構，而在5∶1的支架中未發現網狀結構。由圖11(a)可知，1∶0的斷面和表面微觀形貌相近，凹凸不平,但只有少量孔隙。

圖11 不同質量比海藻酸鈉/碳酸鈣復合水凝膠的斷面形貌

結合表面圖和斷面圖，相對海藻酸鈉與碳酸鈣質量比為1∶0和5∶1的試樣，質量比為10∶1的試樣表面更粗糙，有較多相互纏結的絲狀結構和不規則凹陷，內部為網狀結構，含有較多孔隙。粗糙的表面和絲狀組織可以更好地黏附細胞，有利于細胞的生長增殖。內部的大量微觀孔隙不但為細胞的生長增殖提供更多的空間，更為營養物質的輸送提供通道，因此質量比為10∶1的試樣特征可為細胞的黏附和生長提供良好的結構基礎。

3 結論

(1)復合凝膠內部存在海藻酸鈉/氯化鈣離子交聯和海藻酸鈉/瓊脂糖基團兩種網絡。

(2)不同比例的海藻酸鈉/瓊脂糖復合凝膠含水量差異較小，均處于90%左右。

(3)不同比例的海藻酸鈉與瓊脂糖對復合凝膠的性能均有較大的影響。其中，海藻酸鈉與瓊脂糖的體積比為2∶1的復合凝膠壓縮模量最高，達到0.353 MPa。

(4)加入碳酸鈣后復合凝膠中出現亞微米級孔隙。海藻酸鈉與碳酸鈣質量比為10∶1的復合凝膠表面粗糙，斷面多孔，支架內部存在大量網狀組織，這些特征可以為細胞黏附和生長提供良好的結構基礎。