人工繁養湘華鯪性腺發育的組織學研究

鄒利，李傳武，蔣國民，楊鑫，王金龍

（1.湖南省水產科學研究所，湖南 長沙 410153；2.湖南省水產原種場，湖南 長沙 410153；3.湖南省水產高效健康生產協同創新中心，湖南 常德 415000）

湘華鯪Sinilabeo decorus tungting（Nichols）隸屬鲃亞科Barbinae、華鯪屬Sinilabeo，是湖南省特有的一種野生魚類，在湘、資、沅、澧四水的中上游均有分布[1]。據調查，1996～2000 年湖南沅水流域湘華鯪年產量為7.60 t，2006～2010 年為0.85 t，2016～2018 年年產量僅剩0.1～0.2 t，湘華鯪種群數量急劇減少，資源現狀已為瀕危等級，列為沅水特有魚類國家級水產種質資源保護區重點保護魚類[2]。為保護開發利用野生湘華鯪資源，本課題組在湖南懷化和邵陽等地共收集野生湘華鯪400 余尾，進行人工馴養和繁殖。2011 年在國內首次成功繁育湘華鯪子一代20 余萬尾，分別飼養于湖南省水產科學研究所（池塘）和洪江區橫巖庫區湘華鯪保育點（江河網箱）。目前，我國湘華鯪主要進行了人工繁殖、營養、生長及消化系統組織觀察等研究[3-6]，而有關養殖湘華鯪的性腺發育及繁殖生物學的研究卻未見報道。本研究通過觀察池塘養殖的1～7 齡湘華鯪子一代性腺的組織切片，探究湘華鯪子一代性腺發育特征與規律，以豐富湘華鯪人工繁殖理論，為規?；B殖及資源增殖提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

2011—2017 年，本課題組經人工催產獲得了湘華鯪苗種。1～7 齡湘華鯪子一代分批養殖于湖南省水產科學研究所池塘。于2018 年3 月7 日、4 月8日、4 月23 日和5 月3 日，分四次采集湘華鯪子一代，每次每年齡組采魚4～6 尾，共計154 尾。

1.2 方法

測定實驗魚的全長、體質量，快速解剖，觀察記錄性腺的外形特征，稱量性腺重，計算性腺指數（GSI）＝（性腺質量/體質量）×100%。取性成熟的雌性親本測定絕對懷卵量。絕對懷卵量=（卵巢樣品卵粒數/卵巢樣品重）×卵巢重[7-9]。將性腺切割成小于1 m3的組織塊（幼魚性腺不用切割），組織塊于波恩氏液中固定24 h。固定好的性腺組織塊，經梯度酒精脫水，石蠟包埋切片（厚6～8 μm），HE 染色，最后樹膠封片。Nikon 顯微鏡觀察并攝影，采用Caseviewer 軟件進行測微尺計量。實驗數據用平均數±標準差（Mean±SD）表示[10]，采用Excel 2007 和SPSS 17.0 等軟件進行處理。

2 結果與分析

2.1 湘華鯪的生長與性腺發育

3—5 月，池塘養殖的不同年齡的湘華鯪性腺發育情況如下：1 齡湘華鯪性腺發育處于Ⅰ期末期；2齡湘華鯪性腺處在Ⅱ期；3 齡、4 齡湘華鯪的卵巢和精巢發育基本處于Ⅱ期～Ⅲ期，5 月上旬發現1 尾4 齡雄性的精巢發育至Ⅳ期；5 齡湘華鯪的卵巢處于Ⅲ期～Ⅳ期，5 齡雄性個體的性腺為Ⅳ期；6 齡、7齡個體均性成熟，在3 月卵巢處于Ⅲ期晚期～Ⅳ期早期，在4—5 月性腺為Ⅳ期卵巢或處于向Ⅴ期卵巢過渡的階段（表1）。

在繁殖季節，性成熟的雌性湘華鯪性體指數可達10.97%，卵巢膨大，卵粒清晰可見，脈絡清晰的血管覆在結締組織被膜上（圖版Ⅰ-1），發育到Ⅳ期晚期。成熟卵排出后，卵巢松弛、萎縮、大量充血，呈紅色透明狀，基本無卵粒殘留（圖版Ⅰ-3）。共采集到7尾性成熟雌湘華鯪，絕對懷卵量最少16 046 粒，最多29 127 粒，平均懷卵量為23 509 粒。性成熟雄魚的性腺指數可達5.54%，精巢發育至Ⅳ期晚期，有精液排出，呈乳白色（圖版Ⅰ-2）。精液排出后，精巢呈淡紅色（圖版Ⅰ-4）。

2.2 性腺的形態特征及分期

表1 1～7 齡湘華鯪在池塘養殖條件下的生長和性腺發育情況Tab.1 Growth and gonadal development of 1～7－year－old Sinilabeo decorus tungting cultured in a pond

湘華鯪的精巢成對分布在腹腔上方，大部分呈軸對稱的細線狀或棒狀結構，偶見兩邊精巢大小存在明顯差異。湘華鯪的卵巢同樣成對分布在腹腔上方，大部分成對同形，早期呈細線狀或扁平條狀，成熟時膨大為棒狀或長囊狀。根據湘華鯪的性腺外形和組織切片觀察結果，參考劉筠的分期標準[7]，湘華鯪的精巢和卵巢發育可分為6 個時期。

2.2.1 精巢發育的分期

Ⅰ期精巢呈透明的細線狀，性腺被黑色的腹膜包裹，Ⅰ期的精巢和卵巢不能通過肉眼分辨。切片觀察，精巢橫切面為橢圓或扁圓形。精原細胞（Spermatogonium）零散分布于精巢基質中，細胞直徑為8～15 μm，其細胞核中位，嗜堿性強，呈深紫色，細胞核直徑為5～7 μm（圖版Ⅱ-1）。

Ⅱ期精巢呈白色的細棒狀，質地緊密，Ⅱ期精巢與卵巢可通過肉眼分辨。Ⅱ期精巢相比Ⅰ期精巢，精原細胞數量顯著增加且排列成束，由支持細胞、血細胞等結締組織細胞包裹，形成精小葉雛形。在3—5 月,魚類生長較快，處在Ⅱ期的精巢也快速發育，精小葉快速增加，此時期支持細胞、紅細胞也大量增加（圖版Ⅱ-2、3）。

Ⅲ期精巢呈細棒狀，白色，橫切面呈扁圓形或三角形。Ⅲ期精巢開始出現多種類型的生殖細胞，生殖細胞以小葉腔為單位同步發育。初級精母細胞（Primary spermatocyte）由精原細胞分裂形成，圓形，細胞質為嗜堿性，細胞核染色深，細胞直徑為3.4～4.6 μm，比精原細胞小。由初級精母細胞分裂形成的次級精母細胞（Secondary spermatocyte），平均細胞直徑為2.29 μm，其細胞核的嗜堿性進一步增強，細胞質已經很少。此時期的精巢還有少量精原細胞和精子細胞（圖版Ⅱ-4、5）。

Ⅳ期精巢呈中間渾圓，兩端尖窄的棒狀，乳白色，橫切面為橢圓形或半圓形。到Ⅳ期末，用手擠壓湘華鯪腹部，能從泄殖孔擠出少量白色的精液。此時期的生殖細胞主要由精子細胞（Spermatid）和精子（Spermatozoon）組成，同時也存在少量精原細胞及其他生精細胞。在普通光學顯微鏡下觀察，小葉腔內的精子細胞和精子均呈一個染色很深的圓形；精子細胞平均直徑為1.6 μm，精子頭部平均直徑為

0.9 μm（圖版Ⅱ-6、7、8）。

Ⅴ期精巢柔軟而膨脹，輕壓腹部，大量乳白色的精子會流出泄殖孔。4 月下旬—5 月初，養殖湘華鯪的Ⅳ期精巢經人工催產能順利過渡到Ⅴ期。此期大量精子呈游離狀態分布于小葉腔，而小葉腔中間形成一個空腔并逐漸增大，同時也存在少量精原細胞及其他生精細胞（圖版Ⅱ-9、10）。

Ⅵ期精巢為排精后的精巢，其血管更加明顯而呈淡紅色，其體積也因精子的排出而縮小，但本實驗中雄魚排出的精液量少，與Ⅴ期精巢的組織切片結果差異不明顯。

2.2.2 卵巢發育的分期

Ⅰ期卵巢為白色透明的細線狀，外形與Ⅰ期精巢相似。Ⅰ期卵巢晚期的生殖細胞為卵原細胞和第1 時相的卵母細胞。第1 時相卵母細胞的細胞核大，約占細胞的一半，核中部有1～3 個核仁，細胞直徑13～42 μm，核徑6～25 μm（圖版Ⅲ-1），排列緊密，靠近卵巢壁的卵母細胞生長速度較快。

Ⅱ期卵巢為淡黃色透明的扁帶狀，卵巢開始出現肉眼可見的板層狀結構，即產卵板，明顯區別于Ⅱ期精巢。切片觀察，Ⅱ期卵巢以第2 時相的卵母細胞為主，早期有少量第1 時相的卵母細胞，晚期開始有少量第2 時相的卵母細胞向第3 時相過渡。第2 時相卵母細胞由于胞質的增加，細胞體積快速增大，因此細胞相互擠壓而呈不規則的多邊形；細胞質嗜堿性，HE 染色呈深藍色；細胞核也相應增大，核淺紫色，位于細胞中央；靠近核膜內側分布著核仁，在同一切面核膜內側有4～15 個核仁。第2時相卵母細胞處于初級卵母細胞的小生長期，細胞體積可增加60 倍以上，直徑47～231 μm，核徑25～94 μm（圖版Ⅲ-2、3、4）。

Ⅲ期卵巢為淺黃色的帶狀，肉眼能見少量卵粒。卵巢擴大，分布于卵膜上方的血管較粗大。卵巢中以第3 時相的卵母細胞為主。與第2 時相卵母細胞相比，第3 時相的卵母細胞體積更大，染色較淺。第3 時相卵母細胞處于初級卵母細胞的大生長期早期階段，細胞質中開始出現染成淡紅色的小顆粒，即卵黃顆粒；細胞質的外緣先出現幾層透明的小液泡；卵母細胞卵膜加厚，開始出現較薄的輻射帶，平均厚度為1.4 μm。在質膜的外側有一層扁平的濾泡細胞，其細胞核染色深，且呈扁平狀。第3 時相卵母細胞體積顯著增大，核仁數目增多，細胞直徑165～489 μm，核徑43～186 μm（圖版Ⅲ-5、6）。

Ⅳ期卵巢呈黃色，體積繼續膨大，卵巢膜內包裹著大量淡黃色卵粒。Ⅳ期卵巢以第4 時相卵母細胞為主，早期有少量第2、3 時相卵母細胞，而Ⅳ期末時第4 時相卵母細胞占切片上卵數的85%以上，占切片面積的96%以上，且卵徑大小比較整齊、發育趨于同步。第4 時相卵母細胞處于初級卵母細胞大生長期的晚期，3—5 月，卵黃顆粒迅速積累，充滿了除液泡層外的細胞質，細胞核也發生偏位，輻射帶增厚，平均厚度為3.6 μm。濾泡膜由兩層濾泡細胞構成。第4 時相卵母細胞早期直徑471～1093 μm；而晚期直徑為1374～1764 μm（圖版Ⅲ-7、8）。

Ⅴ期卵巢呈黃色，卵粒游離在卵腔中，輕壓腹部就會流出體外。此期卵粒飽滿，略帶光澤。Ⅴ期卵巢以第5 時相卵母細胞為主，其卵黃顆粒融合成板塊狀，且卵母細胞與濾泡膜處于分離狀態。第5 時相卵母細胞的直徑為（1730.52±89.68）μm（圖版Ⅲ-9）。

Ⅵ期卵巢呈半透明的深紅色，由于成熟卵的排出，卵巢顯著萎縮、大量充血。卵巢中有少量第2、第3 時相的卵母細胞和大量空濾泡，還有極少量正處于退化階段的未產出的卵粒，性成熟個體產卵后的卵巢屬于Ⅵ期卵巢（圖版Ⅲ-10）。

3 討論

3.1 池塘養殖下湘華鯪的性腺特征

據文獻記載，野生湘華鯪群體中雌、雄個體最小性成熟年齡為2 齡，群體完全性成熟需要到3 齡[1,2]。繁殖季節，性成熟的雌性個體性腺指數為（15.72±2.26）%，懷卵量8～10 萬，卵徑（2.11±0.13）mm[1,2]。本研究中，池塘養殖人工繁育的湘華鯪子一代性腺發育良好，能進行催產繁殖。但與野生群體相比，池塘養殖湘華鯪的性腺發育狀況存在以下不同：（1）性腺發育較野生群體遲緩，群體完全性成熟年齡推遲了2 年；（2）養殖群體中性成熟雌魚的性腺指數最高為10.97%，懷卵量2～3 萬，卵徑（1.73±0.89）mm，表明湘華鯪子一代培育的性腺發育還需要進一步研究與探索。性體指數、懷卵量及卵徑是衡量魚類性腺發育和性腺質量的重要數量指標[11]。親魚的性腺發育和卵黃形成是親魚培育的關鍵，此過程受水環境、營養飼料及日常管理等多重因素的影響[12-15]。野生湘華鯪在河灘覓食，分批洄游至有急流的場地產卵，運用池塘循環水槽養殖模式開展仿生態的流水養殖，能否促進養殖湘華鯪的性腺發育，還需要進一步的研究。

3.2 養殖湘華鯪精巢結構及發育特點

魚類精巢從分化到成熟，主要經歷結構和精子發生等變化，一般分為六個時期[16]。魚類的精巢按照生殖細胞的排列方式及分布特點，一般為小葉型精巢和管型精巢兩種類型[7,17-19]。大部分鯉科魚類精巢為小葉型[10,12,20]，本研究組織觀察發現，湘華鯪精巢屬于小葉型精巢。4 齡及以上的性成熟雄湘華鯪，3 月時精巢處Ⅲ～Ⅳ期，在4 月下旬—5 月初精巢可自然發育至第Ⅳ～Ⅴ期，這說明養殖湘華鯪的精巢發育良好，已經具備催產條件。

3.3 養殖湘華鯪卵巢發育及產卵類型

卵母細胞經過兩個生長期發育成熟，第2 時相的卵母細胞的胞質增多為第一個小生長期，第3、4時相卵母細胞的生長為第二個大生長期，此期卵黃顆粒大量積累、輻射膜增厚、細胞核移位[7]。大部分5 齡左右的養殖湘華鯪卵巢才發育至Ⅳ期。養殖湘華鯪雌魚性成熟年齡為5+，大于雄魚的性成熟年齡4+。這可能與雌湘華鯪在性成熟過程中需要更多的營養物質積累有關，尤其是卵黃形成期，除了積累卵黃，還需要合成和積累各類RNA、糖原顆粒、核糖體、脂質及線粒體等物質[21,22]。

根據硬骨魚類卵巢的組織學特征和產卵習性，產卵類型可劃分為一次性產卵和多次性產卵[8,17,23,24]。隨著湘華鯪卵巢發育進入Ⅳ期末，第4 時相卵母細胞占切片面積的96%以上，卵徑大小比較整齊，第3時相卵母細胞已很少，說明湘華鯪卵巢內的卵母細胞是同步成熟。產后的卵巢中基本無第4 時相卵母細胞，第3 時相的卵母細胞處于退化階段，只剩下第2 時相的卵母細胞和大量空濾泡（圖版Ⅲ-10），說明養殖湘華鯪和野生湘華鯪都是一年產卵一次。養殖湘華鯪卵巢發育放緩且一年產卵一次，建議在五月初選擇6 齡以上雌性、5 齡以上雄性的親本進行催產，提高繁殖效率，也有利于親魚保護。

圖版Ⅰ 湘華鯪性腺解剖圖Plate Ⅰ Gonads in Sinilabeo decorus tungting

圖版Ⅱ 湘華鯪的精巢發育Plate Ⅱ Characteristics of testis development at different stages in Sinilabeo decorus tungting