吳門調脂顆粒方對非酒精性脂肪肝大鼠肝組織NF-κBp65/P38MAPK蛋白表達的影響

梁國強，葛惠男，章一凡，歐陽八四，郭金偉，孫 柳，杰 輝，龔 誠，沈賢敏，朱 慧，沈為濂，朱惠萍*

(1.南京中醫藥大學附屬蘇州市中醫醫院，江蘇 蘇州；2.江蘇省名老中醫藥專家葛惠男傳承工作室；3.蘇州市吳門醫派研究院，江蘇 蘇州 215009)

非酒精性脂肪肝病(Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前全人類的一大頑疾，通常指除酒精原因以外，具有其他明確的損肝因素所致的脂肪過度沉積于肝細胞內為主要特征的臨床病理綜合征。其易脂肪性病變轉歸為非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，進一步發展為肝硬化以及肝癌的風險非常大。普通和代謝綜合征的人群患病率分別高達6.0%和25.0%[1]?，F代中醫根據其臨床癥狀認為NAFLD、NASH屬于傳統中醫疾病脅痛、積聚、鼓脹等范疇[2]。當前證實廣泛存在于全身多種細胞之中的轉錄核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和Kupffer細胞免疫相關信號通路絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)，與NAFLD和NASH發生發展中的炎癥、肝纖維化、肝功能衰竭等均存在密切的關系且發揮著重要作用[3]。本研究采用吳門醫派已故中醫消化內科傳人全國名老中醫汪達成治療高脂血癥創制的驗方“吳門調脂顆?！狈?，觀察其干預高脂飲食誘導的經典NAFLD大鼠的效應，并探討對肝組織中NF-κBp65和P38MAPK蛋白調控的初步機制，為該方對NAFLD防治作用的深入研究積累更多的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF級SD雄性大鼠，體質量(200±20)g，購自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2017-0043。飼養條件：室溫(24±2)℃，明暗各半，自由攝食、飲水，適應性飼養7 d用于實驗。

1.2 實驗藥物

吳門調脂顆粒方：水提取物制成的棕黃色浸膏，1g浸膏相當于含量為3.0 g生藥，由蘇州市吳門醫派研究院中心實驗室提供(批號：20191003)；多烯磷脂酰膽堿膠囊(易善復)，賽諾菲(北京)制藥有限公司產品(批號：F733845)；戊巴比妥鈉(Sigma公司生產，批號：20120304)。

1.3 實驗試劑

單試劑GPO-PAP法TG、TC測定試劑盒；雙試劑直接法HDL-C、LDL-C測定試劑盒；紫外比色法ALT、AST測定試劑盒，均為南京建成生物工程研究所產品；ELISA法GSH、IL-1β、TTNF-α、IL-6測定試劑盒，上海邦奕生物公司產品；蘇木素、伊紅染色試劑盒，為鴻泉生物科技有限公司產品；NF-κBp65(ab16502，1∶200)、P38MAPK抗體(ab32142，1∶250)，abcam公司產品；廣譜二抗，上海長島生物技術有限公司產品；其他試劑均為市售分析純。

1.4 實驗儀器

Infinite F50酶標儀(瑞士Tecan 公司)；全自動生化分析儀(美國杜邦公司)；HI1210水浴鍋(Leica公司)；D5100數碼相機(NIKON公司)；CX41正置顯微鏡(OLYMPUS公司)；恒溫烘箱(恒一科學儀器有限公司)；石蠟切片機、攤片機(徠克公司)。

1.5 造模與分組

取53只SD大鼠適應性飼養1周后，分成空白組(n=10)，普通飼料喂養，余43只進行造模，參考文獻[4]予以高脂飼料(88%基礎飼料+10%豬油+2%膽固醇)喂養，于第8周末隨機選取3只大鼠處死，驗證造模成功后改普通飼料喂養，并根據體質量隨機分為：模型組，西藥組(多烯磷脂酰膽堿：80 mg/kg)[5]，中藥低、高劑量組(調脂顆粒方：相當于4 g生藥/kg、8 g生藥/kg，根據人45 g生藥/d與大鼠體表面換算等效劑量為低劑量，高劑量放大1倍)[6]4組(n=10)，空白組及模型組同步予以同體積生理鹽水，各組以10 mL/kg灌胃給予4W。

1.6 標本制作

各組對應藥物干預4周后，末次干預給藥1 h后(禁食16 h)，以戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血后分離血清(3 000 r/min，10 min)，-80 ℃冰箱凍存待測相關指標。行安樂處死后，每組隨機取5個樣本，解剖腹腔，取肝臟組織統一留取右葉，距邊緣5 mm，大小約0.5 mm3，多聚甲醛固定，待病理切片觀察及免疫組化檢測相關指標，殘余肝臟組織儲存于-80 ℃冰箱備用。

1.7 檢測指標及方法

1.7.1 血脂相關指標檢測 分別采用單試劑GPO-PAP法和雙試劑直接法檢測血清TG、TC和HDL-C、LDL-C。

1.7.2 肝酶譜相關指標檢測 分別采用紫外比色法和ELISA法檢測血清ALT、AST和GSH。

1.7.3 血清炎性相關指標檢測 采用ELISA法檢測血清IL-1β、TNF-α和IL-6水平。

1.7.4 肝組織病理形態學觀察 取各組經甲醛固定的肝組織，采用蘇木素、伊紅染色試劑盒進行染色觀察，光學顯微鏡下觀察肝臟組織形態及脂滴分布狀況等。

1.7.5 肝臟NF-κBp65、P38MAPK蛋白表達檢測 采用免疫組化法(IHC)檢測肝組織NF-κBp65、P38MAPK蛋白的表達，包埋各組大鼠肝組織后切片脫蠟制片。PBS漂洗，再于3%甲醇-H2O2、檸檬酸緩沖液及加熱來進行抗原修復?？乖迯秃罄鋮s，以血清封閉，室溫37 ℃、30 min。按要求加入稀釋的一抗置于4 ℃冷庫搖床過夜，一抗解育后漂洗，并加入二抗室溫37 ℃孵育30 min后加入顯色劑，顯色并清洗后浸泡于蘇木精中2 min，進行復染。復染后按常規脫水方法脫水。脫水后用中性樹膠封片晾干。完成的免疫組化片于顯微鏡下觀察、拍攝。

1.8 統計學方法

實驗數據運用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，所得數據表示為均值加減標準差，多組間比較采用ANOVA分析，兩兩比較采用t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血脂相關指標比較

見表1，與空白組比較，模型組TG有所上升但無統計學差異，TC和LDL-C顯著性上升(P<0.001)，HDL-C明顯下降(P<0.05)；與模型組比較，給藥各組TG明顯下降(P<0.05)、HDL-C升高但差異無統計學意義，西藥組和中藥高劑量組TC、LDL-C顯著性下降(P<0.01或P<0.001)，中藥低劑量組TC、LDL-C明顯下降(P<0.05)。

表1 各組大鼠血清TG、TC和HDL-C、LDL-C水平比較

2.2 各組肝酶譜相關指標比較

見表2，與空白組比較，模型組AST明顯升高(P<0.05)、ALT顯著性升高(P<0.01)、GSH顯著性下降(P<0.001)；與模型組比較，給藥各組AST明顯下降(P<0.05)，西藥組和中藥低劑量組ALT明顯下降(P<0.05)，中藥高劑量組ALT顯著性下降(P<0.01)，西藥組GSH顯著性升高(P<0.001)，中藥高劑量組GSH明顯升高(P<0.05)，中藥低劑量組GSH升高差異無統計學意義。

表2 各組大鼠血清AST、ALT和GSH活性比較

2.3 各組血清炎性相關指標比較

見表3，與空白組比較，模型組IL-1β、TNF-α、IL-6水平均顯著性升高(P均<0.001)；與模型組比較，西藥組和中藥高劑量組給藥IL-1β顯著性下降(P<0.001或P<0.01)，中藥低劑量組IL-1β明顯下降(P<0.05)，西藥組TNF-α明顯下降(P<0.05)，中藥低、高劑量組TNF-α下降但差異無統計學意義；西藥組IL-6顯著性下降(P<0.01)，中藥高劑量組IL-6明顯下降(P<0.05)，中藥低劑量組IL-6下降但差異無統計學意義(P>0.05)。

表3 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、IL-6水平比較

2.4 各組肝組織病理形態學比較

切片顯示：空白組大鼠肝組織結構未見明顯病變，肝小葉、肝竇結構清晰，多邊形的肝細胞排列致密整齊，中央見圓形的細胞核且胞質內無空泡；與空白組比較，模型組大鼠肝組織可見肝小葉結構紊亂，肝細胞膨脹性氣球樣變，大泡性、小泡性脂滴同時存在于胞質內，胞核被擠壓至細胞邊緣，可見散在壞死的肝細胞、小葉內炎癥浸潤等明顯的病理性改變。與模型組比較，西藥組和中藥低、高劑量組肝組織脂肪變性及炎癥浸潤情況有不同程度的改善；中藥高劑量總體改善略有優于低劑量組，脂肪變性改善與西藥組相當，但炎癥浸潤改善不及西藥組。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理形態學比較(HE×200)

2.5 各組肝組織NF-κBp65、P38MAPK蛋白表達比較

見圖2、表4。每組隨機取5個樣本進行相關蛋白的IHC進行分析，與空白組比較，模型組大鼠肝組織NF-κBp65顯著性上調(P<0.001)、P38MAPK明顯上調(P<0.05)；與模型組比較，西藥組和中藥高劑量組NF-κBp65明顯下調(P<0.05)，西藥組P38MAPK顯著性下調(P<0.01)，中藥高劑量組P38MAPK下調但無統計學差異，中藥低劑量組NF-κBp65下調、P38MAPK上調但均無統計學差異。中藥兩組NF-κBp65、P38MAPK蛋白表達仍然顯著性高于空白組。

圖2 各組大鼠肝組織NF-κBp65、P38MAPK蛋白表達比較(IHC×200)

表4 各組大鼠肝組織NF-κBp65、P38MAPK蛋白表達比較

3 討論

隨著人們生活水平的提高及生活方式的改變，目前我國NAFLD的發病率已接近20.0%，且呈日益升高趨勢。其發病機理目前比較認同的為“二次打擊學說”，即第一次為高胰島素血癥及胰島素抵抗(Insulin resistance，IR)導致的單純肝細胞脂肪變性，第二次為氧化應激及脂質過氧化、炎性細胞因子的釋放、線粒體功能障礙而導致的肝細胞炎性反應、滑絲及纖維化，甚至導致肝硬化[7]。雖然隨著醫患防控意識的不斷提高，提倡飲食上少吃高脂高糖、提高有氧運動以及戒煙、戒酒和保持良好生活作息習慣等，但是由于現代社會生活節奏快、工作壓力等因素，關鍵的問題是“持之以恒”很難做到。西醫治療主要從胰島素增敏劑、抗氧化劑、改善脂代謝、肝細胞保護劑等幾個方面，雖然效果“立竿見影”，但也伴隨著損傷肝細胞以及反復發作的風險，而且大多數藥物價格昂貴，目前尚未出現特效藥[8]。隨著中醫藥的深入研究和發展，發現中醫藥治療 NAFLD 具有一定的療效和優勢，臨床準確辨證施藥是關鍵，體現出副作用少、療效穩定，尤其適用于慢性患者長期服用[9，10]。

吳門調脂顆粒方的創制依據吳門醫派倡導的絡病學術思想“經年宿疾，病必在絡”的中醫理論，組方為：蒲黃、姜黃、澤瀉和萊菔子。NAFLD雖發病于微，但病變時間長，其主要病理基礎以痰、瘀痹阻脈絡為主。其中蒲黃甘、平，歸肝、心包經，具有活血化瘀通絡為君藥；姜黃辛、苦、溫，歸肝、脾經，行氣活血、痛經止痛，澤瀉甘、淡、寒，歸腎、膀胱經，具有利水滲濕瀉熱，通腎之開合，兩者為臣藥；再佐以辛、甘、平，歸脾、胃、肺經的萊菔子，發揮其消食除脹、降氣化痰的作用。四藥共同體現化痰祛瘀通絡的療效，在多年的臨床治療NAFLD等疾病的實踐中每獲良效[11-15]。在前期的實驗研究中初步亦表明了吳門調脂顆粒方具有對NAFLD小鼠加速對脂質的轉運和代謝，抑制慢性炎癥、調控細胞過度自噬等，保護肝臟的作用[16-19]。

基于以上基礎，本研究中以經典NAFLD大鼠模型為工具，經吳門調脂顆粒方干預后發現，血脂相關指標、肝酶譜相關指標和血清炎癥因子相關指標以及病理形態學分析結果表明：吳門調脂顆粒方高劑量干預可明顯改善NAFLD大鼠的指征和病理特征，這些結果都與吳門調脂顆粒方臨床療效和前期實驗基礎類同。MAPKs是哺乳動物細胞內廣泛存在的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與細胞增殖、分化、轉化及凋亡的調節，并與炎癥、腫瘤及其他多種疾病的發生發展密切相關，而p38MAPK是MAPKs家族控制炎癥反應主要成員，其參與NF-κB、TNF-α等眾多炎癥因子的調控，并與這些炎癥因子形成正反饋調節作用[20-21]。本次實驗結果顯示：吳門調脂顆粒方高劑量具有下調和上調脂肪肝組織P38MAPK和NF-κBp65蛋白表達作用。

綜上所述，本實驗通過高脂飼料誘導的方法成功制備NAFLD大鼠模型，且病變肝組織中NF-κBp65和p38MAPK蛋白表達較正常組顯著上調表達，在吳門調脂顆粒方的干預下，血脂、肝酶譜和炎癥相關指標得到調控性改善，病理學改變減輕，顯著降低了NF-κBp65蛋白的表達，但對p38MAPK蛋白過表達影響相對較弱。提示吳門調脂顆粒方通過化痰祛瘀通絡功用抑制NAFLD引起的肝臟脂質沉積，推斷其主要與調控肝組織中NF-κBp65過表達存在一定關系。在進一步研究中，應該借鑒代謝組學、生物信息學分析以及構建目標蛋白病毒等現代科學技術，對吳門調脂顆粒方干預炎癥因子、氧化應激因子所介導的NF-κB/MAPK通路的整體效應進行系統性研究，多維多息地表征中醫藥治療NAFLD的療效機制。