不同產地丹參藥材中四種丹參酮類成分的定性鑒別和含量測定

胡國輝

(廣州中醫藥大學第一附屬醫院 藥學部，廣東 廣州 510405)

丹參為唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰的功效[1-3]。臨床上主要用于治療心血管疾病、肝臟及神經系統疾病，丹參藥材的活性成分主要分為兩大類，脂溶性成分[4-7]和水溶性成分[8-10]，脂溶性成分主要是丹參酮型的二萜醌類化合物，是丹參活血化瘀、抗炎和抑制血管平滑肌細胞增殖的主要成分，包括丹參酮IIA、丹參酮IIB、隱丹參酮、二氫丹參酮I等，其中丹參酮IIA含量是最高的，也是丹參治療冠心病的主要有效成分之一[11-12]，此外就是丹參的水溶性化學成分，主要是酚酸類化合物，包括原兒茶醛、原兒茶酸、丹參素鈉、丹酚酸A、迷迭香酸、咖啡酸等，丹參的水溶性成分與藥理活性基本相似，均具有抗心肌缺血與缺氧的作用[13-15]，2015版藥典[2]丹參藥材項下脂溶性成分主要是通過一測多評法測定丹參酮IIA、隱丹參酮和丹參酮I的含量及薄層鑒別法鑒別丹參酮IIA，本實驗在前期的預實驗中發現丹參藥材中脂溶性成分二氫丹參酮也可以同時測出，且二氫丹參酮也具有抗菌、抗氧化和擴張冠狀血管等活性，與丹參的藥理作用一致，因此有必要對其進行測定，故本實驗增加丹參酮類成分的定性鑒別及含量測定，從而更加全面控制丹參藥材的質量。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高效液相色譜儀(美國安捷倫儀器公司)，Agilent chemstation色譜工作站，Agilent XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱，硅膠GF254薄層板(10 cm×20 cm)(Merck公司)，乙腈為色譜純(美國Fisher公司)，磷酸為GR級(上海國藥化學試劑公司)；ML204T、XPE205電子分析天平(METTLER TOLEDO公司)。對照品：二氫丹參酮，批號：D101537，含量以98.0%計；丹參酮I，批號：T118876，含量以97.0%計，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；隱丹參酮，批號：110852-200806，含量以98.7%計；丹參酮IIA，批號：110766-201520，含量以98.9%計，購自中國食品藥品檢定研究院。石油醚(60～90 ℃)、乙酸乙酯、環己烷等試劑均購自上海國藥化學試劑公司，不同產地丹參藥材來源見附表1。

表1 丹參藥材樣品來源

2 方法與結果

2.1 四種脂溶性成分的TLC鑒別

取不同產地的丹參藥材粉碎，過二號篩，取粉末1 g，加乙醚10 mL，靜置1 h，然后濾過，濾液揮發溶劑至干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液，另取二氫丹參酮、丹參酮I隱丹參酮和丹參酮IIA對照品，加甲醇制成每1 mL分別含1 mg的溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法(通則0502)試驗，吸取上述供試品溶液和對照品溶液各2 μL，分別點于同一高效硅膠GF254薄層板上，用石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-環己烷(5∶3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，分別在日光及紫外燈(254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點和熒光斑點。見圖1。

注：1.山東泰安薛家莊；2.山東臨沂麥坡村；3.山東臨沂常嶺村；4.山東濰坊臨朐縣；5.四川中江縣金錢村；6.四川廣元蒼溪縣；7.四川廣元青川縣；8.陜西商洛鎮安縣；9.陜西漢中西鄉縣；10.陜西商洛商南縣；S1 丹參酮IIA；S2丹參酮I； S3.隱丹參酮；S4.二氫丹參酮。

2.2 色譜條件

Agilent XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：以乙腈為流動相A，0.03%磷酸為流動相B，按下表2梯度洗脫；柱溫20 ℃，流速1.0 mL·min-1，檢測波長：270 nm；理論塔板數按丹參酮IIA峰計算應不低于10 000。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取二氫丹參酮對照品10.58 mg、隱丹參酮對照品12.39 mg、丹參酮I對照品6.52 mg，丹參酮IIA對照品17.26 mg置同一25 mL量瓶中，加二氯甲烷2 mL，振搖使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為6號對照品溶液；精密吸取6號對照品溶液3 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為5號對照品溶液；精密吸取5號對照品溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為4號對照品溶液；精密吸取4號對照品溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為3號對照品溶液；精密吸取3號對照品溶液，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為2號對照品溶液；精密吸取2號對照品溶液，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為1號對照品溶液。

表1 流動相洗脫程序

2.4 供試品的制備

取山東泰安薛家莊丹參藥材粉末樣品(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理(功率500 W，頻率53 kHz)30 min，取出放涼，再稱定重量，用75%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液用0.45 μm濾膜濾過，即得。

注：A為混合對照品；B為供試品(從左到右四個峰依次為二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA)

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 精密吸取1～6號對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，各進樣2次，按照預實驗確定的色譜條件(C18色譜柱，4.6 mm×250 mm，5 μm，流動相，A為乙腈，B為0.03%磷酸，梯度洗脫，柱溫20 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長：270 nm)測定峰面積，以峰面積的平均值為縱坐標，進樣量的質量(ng)為橫坐標，計算回歸方程，結果見表2。

表2 4種丹參酮類成分的線性方程、線性范圍及相關系

2.5.2 精密度 分別精密吸取上述“2.3”項下的1、3、6號混合對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按照“2.2”項下的色譜條件各進樣6次，結果1號對照品中二氫丹參酮、丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮IIA峰面積的RSD分別為0.55%、0.38%、1.22%和0.76%；3號對照品中二氫丹參酮、丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮IIA峰面積的RSD分別為1.58%、2.02%、1.77%和1.62%；6號對照品中二氫丹參酮、丹參酮I、隱丹參酮和丹參酮IIA峰面積的RSD分別為0.47%、0.51%、0.56%和0.32%，結果表明儀器的進樣精密度良好。

2.5.3 重復性 取山東泰安薛家莊丹參藥材粉末(過三號篩)約0.5 g，精密稱定，共6份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入75%甲醇溶液50 mL，稱定重量，超聲處理20 min，取出放涼，再稱定重量，用75%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液用0.45 μm濾膜濾過，即得。按照“2.2”項下的色譜條件測定，結果二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量值的RSD分別為0.27%、0.58%、0.42%和1.03%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩定性 取上述重復性項下的一份樣品，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h和24 h各進樣1次，按照“2.2”項下的色譜條件測定，結果二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA峰面積值的RSD分別為1.05%、0.92%、0.35%和1.66%，結果表明該供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.5 加樣回收試驗 精密稱取二氫丹參酮對照品6.82 mg，丹參酮I對照品8.56 mg，置同一10 mL量瓶中，加二氯甲烷1 mL使溶解，然后加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為儲備溶液；另精密稱取隱丹參酮對照品5.88 mg、丹參酮IIA對照品7.36 mg，置同一10 mL量瓶中，精密加入上述儲備溶液2 mL，加入甲醇溶解至刻度，搖勻，作為加樣用對照品溶液。另精密稱取山東泰安薛家莊丹參藥材(過3號篩)樣品0.25 g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，每組分別精密加入上述加樣用對照品溶液各1 mL，再精密加入75%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，取出放涼，再稱定重量，用75%甲醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續濾液用0.22 μm濾膜濾過，取續濾液即得。按照重復性項下的色譜條件和對照品溶液進行測定，結果見表3。

表3 丹參藥材中4種丹參酮類成分的加樣回收試驗結果 (n=6)

2.5.6 檢出限和定量限 按照空白溶劑實驗分別計算3倍噪音和10倍噪音作為方法的檢出限和定量限，結果二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的檢出限分別為0.612 μg·g-1、0.307 μg·g-1、0.528 μg·g-1和1.34 μg·g-1，定量限為2.04 μg·g-1、1.02 μg·g-1、1.76 μg·g-1和4.47 μg·g-1。

2.6 含量測定

取不同產地的10批次丹參藥材按照上述“2.4”方法制備，“2.2”項下色譜條件進行測定，測定結果見表4。

表4 丹參藥材中二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA含量測定結果 (%)

3 結果與討論

3.1 標準曲線繪制

由于不同產地藥材中含量差異較大，因此在標準的制備中應充分考慮，本實驗采用逐級稀釋法，等比數列稀釋，最大濃度與最小濃度相差411倍，這樣才能更好地適用于中藥材的含量測定，保證藥材的含量在標曲線性范圍之內。如果采用等差數列進行標準制備，則線性范圍較窄，不能很好地保證適用于所測藥材，如果中成藥含量測定中，由于藥材的產地來源固定，含量相差不大，可以采用等差比例稀釋作標準曲線。

3.2 供試品制備的考察

本實驗在供試品溶液制備過程中分別考察了不同溶劑(甲醇，75%甲醇、50%甲醇、甲醇)，不同提取方法(冷浸、超聲、回流)、不同超聲時間(20 min、30 min、40 min)，超聲功率(150 W、350 W、500 W)，發現丹參酮類化合物不穩定，容易相互轉換，最終考察采用75%甲醇作為提取溶劑、超聲提取方法、提取30 min中功率500 W為最佳供試品制備方法，該條件下4種丹參酮脂溶性成分含量最高，因此選擇上述條件作為供試品溶液的制備方法。同時由于丹參酮類成分對熱和光不穩定，相互之間易于轉換，因此在測定過程中需采用棕色瓶子避光操作，同時超聲時注意溫度控制。

3.3 限度的確定

本實驗通過對10個不同產地的丹參藥材中二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的含量測定，按照2015年版《中國藥典》規定，按干燥品計算，含隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA三者之和不少于0.25%，上述藥材的含量均符合規定，本實驗所測其他批次藥材中的二氫丹參酮中的含量在0.039 2%～0.071 4%之間，四者之和在0.444 9%～0.774 1%之間，平均值為0.603 2%，因此建議規定中增加二氫丹參酮的含量，以平均值的80%計算作為限度較為合理，因此為了提高優質丹參藥材標準，丹參藥材按照干燥品計算，含二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA四者之和不少于0.48%。

本研究建立的不同產地丹參藥材中脂溶性成分二氫丹參酮、隱丹參酮、丹參酮I和丹參酮IIA的TLC鑒別方法，具有斑點清晰、分離良好、含量測定方法分析速度快、靈敏度高的優點，可以用于丹參藥材中4種脂溶性成分的含量測定。