當歸芍藥散治療原發性痛經作用機制探討
——基于網絡藥理學

原 煜，閆怡潔，張文紅

(山西中醫藥大學 第二臨床學院，山西 太原 030024)

痛經是指行經前后或月經期出現下腹部疼痛、墜脹，伴有腰酸或其他不適，其中原發性痛經是指生殖器官無器質性病變的患者，占痛經患者的90%以上[1]，在青年中的發病率較高，嚴重影響患者的生活、工作與學習[2]。其發病機制尚不明確，西醫多采用多種藥物聯合治療，但不良反應較大，副作用較高[3]。原發性痛經為中醫藥治療的優勢病種，臨床多通過辨證論治確立治法，副作用小，治愈率高，效果良好。

當歸芍藥散出自張仲景《金匱要略·婦人病篇》，其中多次用此方治療婦人各型腹痛[4]，本方由當歸、芍藥、白術、茯苓、澤瀉、川芎組成，主治婦人妊娠或經期腹痛，在臨證時多用此方治療原發性痛經。但當歸芍藥散治療原發性痛經的作用機制目前尚不明確，仍需進一步驗證。網絡藥理學多用于研究中藥復方對疾病的作用機制，以及新藥前期開發，是一種基于多種生物信息學技術的預測方法。因此，本課題運用網絡藥理學方法，闡述當歸芍藥散治療原發性痛經的潛在活性成分、靶點、通路及作用機制，以期為臨床提供理論依據及借鑒。

1 材料與方法

1.1 當歸芍藥散活性成分篩選

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php)是一種便捷檢索藥物的工具，其能夠捕捉藥物、靶標與疾病之間的關系。本課題通過 TCMSP 平臺分別搜索當歸芍藥散含有的7味中藥來獲取藥物相關活性成分。由于當歸芍藥散所用芍藥只有一種，無赤芍、白芍之分，后世醫家對此爭議頗多，尚無定論[5]，特將赤芍、白芍均納入范圍，因此本課題所檢索的7味藥物為當歸、白術、赤芍、白芍、茯苓、澤瀉、川芎。檢索藥物的基本信息涉及活性成分名稱、分子 ID、口服生物利用度(OB)及類藥性(DL)等，以OB≥30%、DL≥0.18 為條件對活性成分進行篩選，作為本課題的候選活性成分，篩選每個候選活性成分對應的潛在靶點信息，并去除沒有靶點的成分。

1.2 當歸芍藥散活性成分作用靶點預測

利用 UniProt 數據庫(https：//www.uniprot.org/ )，限定物種為“Homo sapiens ”將獲取的成分靶點蛋白名稱轉換為官方基因名稱，使獲得的成分靶點信息規范統一。最后將當歸芍藥散中藥物、有效成分及其對應的靶點導入 Cytoscape 3.8.0，建立“藥物-活性成分-靶點”網絡進行分析。

1.3 疾病靶點預測

通過DrugBank 數據庫(https：//www.drugbank.ca/)、GeneCards 數據庫(https：//www.genecards.org/)、OMIM 數據庫(https：//omim.org/)，分別以“ primary dysmenorrhea ”為搜索關鍵詞檢索與原發性痛經相關的靶點，集合3個數據庫的靶點進行去重處理。

1.4 藥物-疾病共同靶點篩選

將當歸芍藥散活性成分靶點與原發性痛經疾病靶點輸入 Venny 2.1.0(https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html )在線工具，構建韋恩圖，得到共同靶點。

1.5 蛋白質相互作用(PPI)網絡構建與分析

將上述篩選出的共同靶點導入 STRING 數據庫(https：//string-db.org/ )，物種選擇為“ homo sapiens ”，設定置信度閾值> 0.4，獲取蛋白間的互作網絡，下載 tsv 文件并導入Cytoscape 3.8.0 軟件中進行可視化處理，并利用 NetworkAnalyzer功能計算節點度(Degree)參數；使用插件cytoHubba 及MCODE 進行分析。

1.6 共同靶點的GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析

將共同靶點導入 Metascape 數據庫，物種設定為“H.Sapiens ”進行 GO 功能富集分析及KEGG 信號通路富集分析，以P<0.05 為篩選條件，得到分析結果。對排名前10的生物學過程(Biological Process，BP)、細胞組分(Cellular Component，CC) 及分子功能(Molecular Function，MF)繪制 GO 分析條形圖，對排名前20的 KEGG 通路繪制氣泡圖，并篩選出可用于解釋當歸芍藥散治療原發性痛經的通路。

2 結果

2.1 當歸芍藥散活性成分與潛在靶點預測

閾值設定為OB≥30%、DL≥0.18，刪除無對應靶點的化合物，最終共收集到當歸活性成分2種，靶點69個；白芍活性成分8種，靶點123個；赤芍活性成分14種，靶點156個；茯苓活性成分6種，靶點30個；白術活性成分4種，靶點23個；澤瀉活性成分7種，靶點9個；川芎活性成分6種，靶點42個。刪除重復有效成分、靶點后，當歸芍藥散有效成分38種，相關靶點144個。

2.2 藥物-活性成分-靶點網絡

將上述篩選結果導入 Cytoscape 3.8.0軟件以藥物-活性成分-靶點網絡的形式呈現(見圖1)。該網絡由189個節點及499條邊組成，其中，菱形節點表示藥物，三角形節點表示活性成分，圓形節點表示靶點，圍繞同一菱形節點的同色三角形表示該藥物的活性成分。內圈三角形節點為藥物的共有活性成分：A1、A2、A3來源于白芍及赤芍；B1來源于當歸及赤芍；C1來源于當歸、白芍及赤芍；D1來源于白芍、赤芍、川芎及澤瀉。

對網絡進行拓撲分析發現，節點度值明顯高于其他成分且度值大于100的有效成分為beta-sitosterol(β-谷甾醇)，相關藥物為當歸、白芍和赤芍?；诰W絡藥理學算法理論，從單個化合物-靶點網絡的角度考慮，β-谷甾醇可能代表這個組方的大部分療效，即可能是當歸芍藥散的主要療效物質。

圖1 當歸芍藥散藥物-活性成分-靶點網絡

2.3 原發性痛經疾病靶點篩選結果

通過 DrugBank、GeneCards、OMIM 等數據庫，共搜集到原發性痛經相關靶點409個，去重處理后，疾病靶點總計335個。

2.4 藥物-疾病共同靶點篩選

將當歸芍藥散144個靶點及原發性痛經335個靶點輸入Venny 2.1.0，繪制韋恩圖(見圖2)，取交集得到共同靶點40個。

圖2 當歸芍藥散-原發性痛經共同靶點韋恩圖

2.5 蛋白質相互作用(PPI)網絡構建與分析

將40個共同靶點導入STRING 數據庫獲取蛋白質相互作用關系，并導入 Cytoscape 軟件繪制蛋白關系 PPI 網絡圖(見圖3)。該網絡包括40個節點、352條邊，其中節點表示蛋白，邊表示蛋白間的相互作用關系。節點的大小、顏色與此節點的度成正比，即節點越大、顏色越深對應蛋白的degree 值越大。利用 NetworkAnalyzer 功能分析各節點的拓撲參數，計算得到 degree 的平均值為17.6。

使用插件 cytoHubba 計算出得分較高的關鍵作用靶點(見圖4)，包括 TP53、IL6、AKT1、VEGFA、TNF、PTGS2、ESR1、CASP3、CXCL8、FOS，這些靶點在蛋白網絡中具有重要的樞紐地位，在當歸芍藥散治療原發性痛經中具有重要意義，可作為其有效成分作用的靶點。對 PPI 網絡進行 MCODE 模塊化分析(見圖5)，共有3個模塊，表明各模塊中的蛋白聯系緊密，它們可能共同執行著某個生物過程，如模塊1與細胞對激素刺激的反應、對類固醇激素的反應，以及對 DNA 結合轉錄因子活性的調節有關；模塊2與缺乏配體時的信號轉導、缺乏配體時的外源性凋亡信號通路及B 細胞穩態有關；模塊3與雌激素代謝過程、視黃醇代謝過程、原醇代謝過程有關。

圖3 共同靶點 PPI 網絡

圖4 關鍵靶點的蛋白相互作用網絡

圖5 PPI網絡的模塊分析

2.6 GO功能富集分析和 KEGG 通路富集分析

GO功能富集分析結果顯示，40個交集靶點共涉及1 037個生物過程(BP)、19個細胞組分(CC)和68個分子功能(MF)。P值越小，蛋白質生物學功能的顯著性越高，故將以上結果按P值升序排序。圖6列出了 GO 功能富集分析中P值排名前10位的結果，各條目的數值代表該組富集分析所含有的基因數。其中，生物過程主要涉及細胞因子介導的信號通路、對脂多糖的反應、對類固醇激素的反應、細胞增殖的負調控等；細胞組分方面主要參與膜筏、膜微區、核轉錄因子復合物、血小板α顆粒等；分子功能主要涉及雌激素16α-羥化酶活性、血紅素結合、雌激素2-羥化酶活性、鐵離子結合、類固醇羥化酶等方面，結果表明，當歸芍藥散參與調控體內多種生物學過程，從而發揮治療原發性痛經的作用。

KEGG通路富集分析結果顯示，40個交集靶點共涉及98條通路過程。對當歸芍藥散治療原發性痛經有顯著影響的生物途徑進行篩選，結果顯示，其機制主要涉及花生四烯酸代謝、雌激素信號途徑、卵巢類固醇生成、類固醇激素生物合成、T 細胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路、HIF-1 信號通路等。圖7中橫軸代表富集分數，氣泡的大小代表基因數，氣泡的顏色代表 pvalue 值。

圖6 GO富集分析

圖7 KEGG 富集分析

3 討論

基于女性特殊的生理特點，加之情志與生活等因素的困擾，婦科疾病的病因常為肝郁。婦人以血為用，肝藏血為血海，肝郁使氣機阻滯、血液運行失常而致血瘀；肝郁犯胃致脾胃運化失常而脾虛濕蘊，故原發性痛經患者常為肝郁氣滯血瘀、脾虛血虧濕蘊所致。當歸芍藥散具有養血調肝、健脾利濕等功效[6]，治療原發性痛經療效顯著?，F代藥理學研究[7]表明，當歸具有補血、增強免疫、調經止痛等藥理作用。白芍具有解痙、鎮痛、抗炎、調節免疫、抗氧化、補血調經等藥理作用[8]。赤芍具有保肝、抗血栓、散瘀止痛、清熱涼血等藥理作用[9]。白術具有抗炎、胃腸調節及抗抑郁等藥理作用[10]。茯苓具有免疫調節、抗炎、抗氧化、抗衰老等藥理活性[11]。川芎具有鎮痛鎮靜、改善血管功能、保護神經細胞、解熱、抗炎等藥理作用[12]。澤瀉有利尿、抗氧化、抗炎、調節免疫等藥理作用[13]。因此，當歸芍藥散各藥物的藥理作用明確，可干預人體多個生物過程，激發機體調控網絡，其治療原發性痛經的機制分析如下。

3.1 核心成分及核心靶點

本課題通過對當歸芍藥散藥物-成分-靶點網絡的剖析發現，β-谷甾醇度值明顯高于其他化合物，該化合物存在于當歸、白芍、赤芍中，研究[14]發現，β-谷甾醇具有明顯的抗炎、抗氧化、抗焦慮作用，其潛在重要的作用靶點孕酮受體、前列腺素G/H合酶1、前列腺素G/H合酶2均參與了原發性痛經的激素調節通路。cytoHubba結果顯示，TP53、IL6、CXCL8、AKT1、VEGFA、TNF、PTGS2、ESR1、CASP3、FOS 等為治療原發性痛經40個靶點中潛在的重要靶點。

TP53 編碼的蛋白對多種細胞應激反應，調節表達靶基因從而誘導細胞周期的改變[15]。T細胞分泌的 IL-6 可強烈收縮子宮，造成局部缺血缺氧，發生炎性反應，使宮腔內組織壞死導致痛經[16]。CXCL8 可以與特異性受體結合，參與調節炎性反應，起到調節女性生殖、生理及病理的作用。AKTI與VEFG 可參與調節血管重塑及血管再生的重要過程，推測 AKT1 在經期利于子宮內膜的恢復，可能與其可以促進新生血管內皮生長有關[17]。作為多效細胞因子的 TNF 在不同的生理、病理條件下產生不同的刺激，參與樹突細胞、B細胞、T細胞的發育，誘導細胞凋亡與炎癥反應[18]。PTGS2是前列腺素生物合成中的關鍵酶，與前列腺素的生物合成有關，而痛經的發生主要與子宮內膜前列腺素含量升高有關，故 PTGS2 可能為關鍵基因靶點。ESR1 對性發育及生殖功能至關重要，它編碼的雌激素受體與雌激素結合，激活血清中的肥大細胞，釋放致痛物質從而導致痛經[19]。c-fos在生理狀態下參與細胞生長分化，但在病理條件下則調控疾病的發生發展[20]。作為細胞凋亡的主要終末剪切酶，CASP3 是 CTL 細胞殺傷機制的重要組成部分。綜上，當歸芍藥散通過調節以上重要靶點，從而達到治療原發性痛經的作用。

3.2 關鍵生物過程

由富集分析的結果可知，當歸芍藥散治療原發性痛經的通路較多，涉及雌激素信號途徑、卵巢類固醇生成、花生四烯酸代謝、類固醇激素生物合成、PI3K-Akt 信號通路、HIF-1信號通路、MAPK 信號通路、T 細胞受體信號通路、膽堿能突觸等信號通路，其中，花生四烯酸代謝及雌激素信號通路起關鍵作用。研究表明，前列腺素在原發性痛經的形成中至關重要，而其生成卻受性激素的調節，故原發性痛經與月經周期中的性激素變化密切相關。黃體中期的雌激素高峰在月經前期可促進生成子宮內膜 PGF2α 。孕激素可促進雌二醇轉化為無活性的雌酮，當歸芍藥散活性成分與體內的雌激素競爭受體，產生類雌激素作用，在不增加子宮內膜 PCF2α 的前提下可減少生成前列腺素[21]，減緩子宮的異常收縮，從而緩解痛經[22]。研究[23]發現，MAPK 蛋白在子宮內膜異位癥患者的病灶中高表達，這與雌激素對 MAPK 信號通路的激活有關，在鞘內注射 MAPK 信號通路抑制劑可使疼痛消失、病灶縮小，推測原發性痛經的發生可能也與雌激素對MAPK信號通路的激活表達有關?；ㄉ南┧岽x通路主要參與的基因為 ALOX5、PTGS1、PTGS2，PTGS1、PTGS2為花生四烯酸合成前列腺素類物質的關鍵性限速酶的異構酶，PTGS2又稱為環氧化酶2 (COX-2)，是生成前列腺素的關鍵酶，其表達在正常生理狀態下不易被檢測到，僅在轉錄水平被細胞因子、生長因子等刺激而迅速誘導上調，進而催化花生四烯酸產生多種前列腺素，導致疼痛及炎癥反應[24]。若 COX-2 的表達過高，則導致持續收縮子宮肌層從而發生痛經[25]。故當歸芍藥散可通過該花生四烯酸代謝通路降低前列腺素的生成，減緩痛經程度。此外，當歸芍藥散還通過 IL-17、Th17 細胞分化等信號通路參與抗炎癥機制，通過 T 細胞受體、Toll 樣受體、NOD樣受體等信號通路參與免疫調節，通過 NF-kappa B 信號通路、鞘脂信號通路、PI3K-Akt 信號通路等參與細胞周期，通過5-羥色胺能突觸、膽堿能突觸等信號通路參與中樞神經鎮痛機制。

4 結語

綜上，當歸芍藥散為多成分、多靶點、多通路的經典方，主要通過激素調節、中樞鎮痛、炎癥、免疫及細胞周期等方面實現對原發性痛經的治療作用，但本課題僅在數據庫與軟件層面研究其作用機制，今后還將在臨床試驗及動物實驗層面加以驗證、完善。