聚乙烯醇納米復合水凝膠促進感染創面愈合的作用研究*

丁燕鋒，胡 皓，陳正榮，高 明△，賀茂林△

（1.廣西醫科大學廣西生物醫藥協同創新中心 廣西－東盟重大疾病防治協同創新中心，南寧 530021；2.廣西醫科大學第一附屬醫院，南寧 530021）

近年來隨著抗生素的濫用，細菌逐漸出現耐藥性[1]。同時，由于血藥難以有效抵達創面部位，導致口服和靜脈抗生素對皮膚感染創面的治療效果欠佳[2]。常見敷料如脫脂棉紗布不能保持傷口濕潤，同時刺激瘢痕形成[3]。通過觀察家豬傷口的愈合，Winter[4]提出了“濕潤傷口愈合理論”，認為濕潤環境傷口愈合更快。然而，傷口濕潤易引起感染，如何保持傷口濕潤并抑制病菌生長是值得探討的問題。為解決該問題，一系列的抗菌水凝膠被開發。Ito 等[5]在聚乙烯醇(PVA)水凝膠中搭載磺胺嘧啶；Zhou等[6]在聚二烯丙基二甲基氯化銨復合水凝膠中搭載Ag/AgCl；Montaser等[7]在無紡布織物上填充海藻酸鈉溶膠，同時搭載煙酰胺；Monerris 等[8]在肼改性聚乙烯醇（PVANN）水凝膠中搭載納米。不同于以往的工作：獨立于水凝膠外搭載抑菌物，本課題通過改性PVA并與具有抑菌效果的銅離子（Cu2+）交聯[9]，從而將CuCl2鎖定在水凝膠中并緩慢緩釋，簡化了抑菌水凝膠的制備。本研究旨在分析PVANN+CuCl2水凝膠的抑菌活性及促進感染創面愈合的能力，為感染創面的臨床治療提供思路。

1 材料與方法

1.1 動物與病菌 清潔級SD 大鼠6 只，體重180～220 g，5 日齡SD 大鼠2 只，均購自廣西醫科大學實驗動物中心，動物許可證號：SYXK（桂）2020-0004。飼養環境：通風良好，環境清潔，室溫20～25 ℃。金黃色葡萄球菌購自魯微生物。

1.2 主要試劑與儀器 PVA購自Mackin；二甲基亞砜（DMSO，99.9%）、N,N’-羰基二咪唑（CDI）、氘代DMSO和三硝基苯磺酸（TNBS）均購自Sigma；水合肼購自天津富宇；二水氯化銅（CuCl2?2H2O）購自天津博迪；透析袋（截流分子量3500）和噻唑藍（MTT）均購自Solarbio；細胞培養基購自Gibco；胎牛血清（FBS）購自杭州四季青；活死細胞染液購自ThermoFisher Science。傅立葉紅外儀產自PerkinElmer；核磁共振儀產自Bruker；電子顯微鏡產自Tescan，VEGA3；顯微鏡產自Olympus。

1.4 PVANN 的合成 稱取1.5 g PVA 充分溶解于30 mL DMSO 中。干燥下稱取8 g CDI 迅速加入上述溶液，搖床震蕩8 h。然后量取8 mL 80%水合肼，加入前述反應體系，繼續搖床震蕩24 h。最終反應溶液用透析袋透析3 d，每6 h 換透析液1 次。透析后，將透析袋內產物（PVANN）凍干。PVA也用同樣的方法透析并凍干。

1.5 TNBS 檢測肼基 PVA 和PVANN 分別分散于超純水，濃度為5%（w/v）。各自取溶液100 μL置入8連管中后加入5%TNBS水溶液5 μL，用移液槍吹打混勻后，靜置1 h，觀察顏色變化。

1.6 紅外表征 分別稱取50mg 凍干PVANN 和凍干PVA，壓成致密柔軟薄片，使用紅外光譜儀檢測500～4 000 cm-1波長范圍的紅外吸收光譜。

1.7 核磁共振表征 分別稱取20mg PVA 和PVANN，分散于400 μL 氘代DMSO 后加入核磁管內。核磁共振儀測試35～165 ppm 的13C 核磁共振譜。

1.8 水凝膠的物理交聯 水凝膠定義為PVA 和PVANN 與CuCl2溶液充分混勻后靜置交聯30min，然后倒置3min，液體沒有流落視為凝膠，否則為溶液。預先配制30%（w/v）PVA 和PVANN 水溶液以及0.5 mol/L CuCl2水溶液。取500 μL 的PVA 和PVANN 水溶液，加入20 μL 0.5 mol/L CuCl2充分混勻，靜置30 min后倒立3 min，觀察溶液滑落情況。

1.9 交聯水凝膠的掃描電鏡 濃度及混合方法同1.8，將各自交聯30 min 后的混合物凍干后切取薄片，粘于導電膠后噴金，掃描電鏡觀察微觀結構。

1.10 體外抑菌實驗 涂布法將200 μL含金黃色葡萄球菌（1×106CFU/mL）的生理鹽水均勻涂布在固體LB 培養基上，并劃分4 個區域，分別加入PVA 溶液、PVA+CuCl2溶液、PVANN 溶液、PVANN+CuCl2溶液。37 ℃培養12 h后觀察菌落生長情況。

1.11 細胞毒性檢測 用MTT 法檢測改性材料的細胞毒性。提取5日齡SD大鼠骨髓間充質干細胞，將其傳代至P3 代后種植于96 孔板（8000 個細胞/孔），分為6 組，每組設3 個復孔，分別加入10 μL PBS、PVA、PVANN、PVA+CuCl2、PVANN+CuCl2、DMSO（陽性對照）。繼續培養24 h 后除去培養液，PBS清洗3遍，加入0.5 g/L MTT培養液100 μL。繼續培養4 h 后小心吸去上清培養液，烘箱烘干后加入100 μL DMSO，搖床震蕩30 min后用酶標儀測定490 nm波長處的吸光度值。同時，用活死細胞染色驗證材料對干細胞的毒性。將軟骨細胞種植于爬片上并用同樣的方法處理細胞，PBS清洗爬片，避光將其浸入含有Calcein-AM 和PI 的PBS 中孵育10 min。PBS沖洗3遍后置于載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察細胞活死情況。

1.12 復合水凝膠感染創面實驗 取180～220 g SD 大鼠6 只，隨機分為3 組。2.5%戊巴比妥鈉約0.3 mL腹腔注射麻醉，電動剃刀將大鼠背部毛發剃除。用手術刀在大鼠背部剝離直徑約1.5cm的皮膚缺損，在缺損處用紗布涂布含金黃色葡萄球菌（1×106CFU/mL）的生理鹽水，完成傷口感染模型。涂抹菌液后，在3 組大鼠傷口上分別覆蓋生理鹽水、PVA+CuCl2混合物、PVANN+CuCl2混合物。5 d 后觀察傷口愈合情況。

2 結果

2.1 TNBS檢測肼基團 肼基能快速與TNBS發生顏色反應[10]，使溶液從黃色變為紅色。而羥基不能顯色，從而檢驗肼基團是否接枝成功?；靹虿⒎跤? h后，可見PVANN能與TNBS發生顏色反應，使溶液從黃色變為明顯的紅色，而未改性的PVA組則未見顏色變化，說明本合成方法成功將肼功能團枝接到PVA上，見圖1。

圖1 用5%TNBS檢驗5%PVA和PVANN時的顏色變化

2.2 水凝膠的紅外表征 經過紅外表征可見PVANN 在1699 cm-1出現強吸收峰，應歸為C=O。符合預期的反應設計，說明肼基團成功通過脂鍵枝接于聚乙烯醇上，見圖2。

2.3 水凝膠的13C 核磁共振表征 對PVA 及PVANN 進行13C 核磁共振表征，PVANN 在158.5 ppm出現信號峰，歸屬為橋接肼基團和PVA主鏈的脂鍵的碳原子，見圖3。

圖2 改性前PVA（下）和改性后PVANN（上）的紅外吸收光譜

圖3 改性前PVA（下）和改性后PVANN（上）的13C核磁共振譜

2.4 水凝膠的物理交聯 PVANN 和CuCl2在反應30 min 后，倒置3 min 混合物仍能粘附于瓶底而不滑落。而PVA 和CuCl2在反應30 min 后，倒置后滑落。說明經肼基團改性的PVANN 能與CuCl2充分交聯形成水凝膠，見圖4。水凝膠從玻璃瓶中取出，可見柔軟、有粘性的水凝膠，見圖5。

圖4 充分交聯后玻璃瓶內水凝膠形成情況

圖5 充分交聯后水凝膠的特征

2.5 凍干水凝膠的微觀形態 電鏡可見PVA 呈石棉樣絲狀，而在PVANN 中可見其微觀結構為海綿狀。在加入氯化銅進行交聯后，其交聯程度明顯增加，空泡大小減小。說明PVANN 能有效交聯形成網絡，見圖6。

2.6 水凝膠的體外抑菌作用 單純PVA和PVANN周圍未見抑菌圈形成，底部有小菌落形成；含CuCl2的PVA 迅速流動覆蓋大片培養基，其底部沒有菌落，周圍未見抑菌圈，說明其具有抑菌作用，但無法固定在原位；經CuCl2交聯的PVANN 被固定于原位，且周圍可見明顯的抑菌圈，見圖7。

圖6 電鏡觀察PVA、PVANN和用CuCl2進行交聯的PVA-Cu、PVANN-Cu凍干后的結構（放大200倍，標尺：200 μm）

圖7 體外抑菌實驗

2.7 水凝膠的生物相容性 皮膚的修復依賴于干細胞的擴增和分化，對干細胞的毒性將影響創面的愈合。通常DMSO被認為具有較低的細胞毒性，與DMSO相比，PVA、PVA-CuCl2、PVANN、PVANN-Cu-Cl2的細胞毒性明顯較低（P＜0.001）。盡管有重金屬Cu2+的存在，但其對細胞的毒性遠較DMSO 弱?；钏兰毎驳贸隽讼嗨频慕Y果，見圖8。

2.8 復合水凝膠感染創面實驗 5 d后觀察傷口愈合情況，生理鹽水處理的傷口和PVA覆蓋的傷口未見明顯愈合，傷口明顯流膿，有血性液體滲出，傷口大小未見明顯減小，并散發出惡臭氣味。PVA-Cu覆蓋的傷口，傷口輕度縮小，傷口表面少許膿痂。而PVANN-Cu 復合水凝膠覆蓋的傷口未見膿性液體，傷口邊緣雖然有紅腫，但未見血性滲出物，亦無惡臭，傷口大小變小，見圖9。

圖8 復合水凝膠的生物相容性

圖9 復合水凝膠在體抑菌情況

3 討論

銅（Cu）是人體新陳代謝所必需的微量元素，成年人體內含100～150 mgCu，且每天需攝入3～5 mgCu才能維持新陳代謝平衡。Cu是銅酶催化所必需的，在造血、神經系統、組織修復、骨礦化等方面發揮重要作用。盡管過量Cu對人體具有毒性，但仍有較大的安全窗口區，通常超過人體需要量的100～150 倍時，可引起壞死性肝炎和溶血性貧血[11]。例如含Cu宮內節育器（IUD）利用Cu2+的抗生育作用而成為我國育齡婦女最廣泛采取的避孕措施。Liu等[12]發現放置含Cu IUD不同年限婦女的宮頸粘液含Cu量可達（2.66±0.58）μg/g，但董白樺等[13]對放置IUD的婦女的子宮內膜進行檢查，未發現對內膜上皮有明顯毒害，同時運用PCR技術未發現含Cu IUD對子宮內膜有致癌作用。在本研究中，無論在MTT實驗中還是在大鼠模型中均未發現含Cu水凝膠有明顯毒性，這是由于傷口敷料僅需少量水凝膠即可覆蓋傷口，并且絕大多數的Cu2+螯合于水凝膠中緩慢釋放，并在緩釋后浸潤組織而稀釋，因此對機體沒有明顯毒害。

本研究通過紅外、碳譜、TNBS試驗證明了肼基改性成功；溶液滑落試驗證明了PVANN交聯了Cu2+后具有凝膠力學特性；電鏡觀察冷凍水凝膠微觀結構的變化，由PVA 的絲狀結構變為PVANN 的泡沫狀微觀結構，可能是由于側鏈枝接了較大分子，結晶性降低；通過MTT試驗證明了含銅水凝膠的生物毒性小于DMSO；通過檢測帶菌固體LB 培養基上抑菌圈大小和動物感染模型創面狀態驗證了材料在體內、外均可抑制金葡菌的生長，從而抑制細菌生長對傷口修復帶來的不利影響。本研究為臨床創傷、感染的處理，減少抗生素的使用提供了新思路。