鴨源性H6N6禽流感病毒對小鼠致病性研究*

李程頤，林裕貴，鐘偉娟，高靈茜，張增峰

（廣西醫科大學基礎醫學院微生物學教研室，南寧 530021）

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）H5N1、H7N9、H5N6 持續不斷地從禽類跨越種屬屏障感染人，對人類健康構成嚴重威脅[1-4]。同時，H6N6亞型AIV 在歐亞大陸的野生水禽、家養水禽以及陸禽廣泛流行，其宿主范圍逐漸擴大至哺乳動物豬[5]，病毒持續進化是否演化為感染人的潛能仍未完全清楚。本文將分離到的鴨源性H6N6亞型AIV進行基因測序和分析病毒基因特點，然后將病毒感染小鼠，觀察病毒對小鼠的致病性以及具有感染小鼠能力的病毒的分子特性，評估鴨源性H6N6 亞型AIV跨種屬傳播哺乳動物的潛能。

1 對象和方法

1.1 病毒來源 選用從水禽鴨分離到的3株H6N6亞型 AIV，包括 A/DK/KM/1135/2019（簡稱KM1135）、A/DK/GY/1774/2019（簡稱GY1774）、DK/GY/6952/2019（簡稱GY6952）。選擇先前已證實能感染小鼠的A/CK/ZZ/346/2014（簡稱ZZ346）作為小鼠感染試驗的陽性對照毒株。4株病毒在10 d無特定病原體的雞胚分離培養。血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）試驗鑒定病毒血凝素（hemagglutinin，HA）亞型，直接測序法鑒定病毒神經氨酸酶（neuraminidase，NA）亞型。

1.2 TCID50（50% tissue culture infective dose）檢測病毒毒力 首先在96孔板接種MDCK細胞，第2天在37 ℃條件下，用10 倍系列病毒濃度吸附MDCK細胞1 h，然后吸掉病毒孵育液，Hank’s液清洗細胞一遍，每孔加入含有終濃度為2 μg/mL TPCK（tosylamido-2-phenyl ethyl chloromethyl ketone）-胰酶的病毒培養液DMEM，37 ℃孵育72 h,最后檢測用HA試驗檢測病毒的滴度。根據Reed和Muench方法對病毒滴度進行計算，計算病毒的TCID50/100 mL。

1.3 基因測序和分析 RNeasy 試劑盒提取病毒RNA并逆向轉錄，PCR反應擴增，純化產物，采用Illumina 的Solexa 系統上機測序病毒全基因，使用全球共享流感數據庫準備相關病毒數據，用Bioedit進行序列比較和同源性分析3 株H6N6 病毒8 個基因節段氨基酸位點的變化，重點分析與受體特異性相關的HA 第224、第226、第228、第186、第190、第158、第137、第156、第263和第318位氨基酸以及與病毒復制和毒力相關的PB2 第627、第271、第701位氨基酸。

1.4 動物和動物感染試驗 60 只6～8 周齡的SPF級BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。所有動物鼻咽拭子接種MDCK 證實沒有流感病毒，HI檢測血清流感病毒抗體陰性。本研究獲得廣西醫科大學動物倫理委員會的批準，動物實驗在生物安全二級實驗室中進行，動物實驗過程中嚴格遵守本單位對實驗動物的護理和使用指南。為探索H6N6AIV 在小鼠體內的復制，通過隨機數發生器將60 只BALB/c 小鼠分為5 組（n=12），實驗組分別接種1 株H6N6 病毒，陽性對照組接種雞源H6N6 病毒，空白對照組用PBS 代替病毒液。動物麻醉后通過滴鼻的方式接種，每只動物接種0.2 mL 106EID 含病毒PBS 或0.2 mL PBS。接種后14 d 內每天記錄動物體重、體溫、疾病癥狀。接種后1 d、3 d、5 d、7 d取動物咽拭子，標本在雞胚和MDCK分離培養病毒。接種后3 d、5 d、7 d 分別用頸椎脫臼法處死每組3 只小鼠，收集氣管、肺組織，每份組織標本分成兩份，一份研磨、離心取上清液，雞胚和MDCK分離培養病毒，另一份放入10%福爾馬林溶液室溫下固定24 h，用于病理學檢查和病毒蛋白的檢測。接種后14 d，眼球采血、收集血清，HI試驗檢測恢復期血清抗體。

1.5 病理學檢查和病毒蛋白抗原檢測 取上述麻醉安樂處死小鼠的呼吸道組織，組織固定、脫水、包埋，連續切片，切片厚度為4 μm。切片常規蘇木精－伊紅（HE）染色，光學顯微鏡下觀察病理變化。免疫組化法檢測病毒蛋白抗原如前所述，高溫高壓抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，滴加一抗抗流感病毒核蛋白（NP）的小鼠單克隆抗體（1∶2 500），4 ℃冰箱孵育過夜，然后滴加二抗（1∶50）山羊抗鼠IgG特異性生物素復合物，DAB顯色，蘇木精復染。

2 結果

2.1 基因測序和分析結果 3株病毒株HA連接位點為單堿性氨基酸連接點PQIETG/GL，屬于低致病性模式。3 株病毒株HA 的主要的受體結合位點224、226、228、190、137 位點未發生突變，仍具有與禽源受體結合的特性。3 株病毒的NA 頸區未見突變或氨基酸缺失，具水禽源性病毒的特點。PB1-F2關鍵位點66以及PA關鍵位點38的氨基酸未發生變化，仍表現出在禽類動物復制、流行的性狀，見表1、表2。

表1 3株鴨源H6N6病毒的HA氨基酸序列

表2 3株鴨源H6N6病毒的NA、PB2、PB1-F2氨基酸序列

2.2 H6N6 亞型AIV 接種BALB/c 小鼠后病毒分離培養和血清抗體檢測結果 H6N6 亞型AIV 接種BALB/c 小鼠后，小鼠活動減少、飲食減退、被毛較粗亂，體溫正常，未出現疾病癥狀和體重下降。在咽拭子標本當中，接種KM1135病毒株后，有3只（3/12）小鼠雞胚病毒分離培養陽性，接種GY1774毒株后有1 只小鼠陽性（1/12），接種GY6952 毒株后，所有的小鼠均未分離到病毒。在小鼠鼻甲、氣管、肺研磨液中，KM1135 病毒株接種的小鼠雞胚病毒分離培養陽性，以鼻甲、肺組織最為明顯；GY1774 接種的小鼠中，3只小鼠病毒分離陽性，其它動物病毒分離陰性；GY6952 僅有1 只小鼠病毒分離陽性，其它動物病毒分離陰性；MDCK 細胞分離結果為KM1135病毒株感染的小鼠鼻甲、氣管、肺研磨液分離培養病毒陽性，而GY1774 和GY6952 陰性。因此，鴨源性H6N6病毒能在小鼠復制，但不同的毒株其復制能力有差異。接種病毒后第14 天，采集BALB/c 小鼠血液樣本，HI 試驗檢測血清中流感病毒抗體滴度，結果顯示3 株病毒恢復期血清樣本抗體陽性，見表3。

2.3 H6N6 亞型AIV 接種BALB/c 小鼠后病理變化和病毒抗原分布 H6N6 病毒接種BALB/c 小鼠后第3、第5、第7 天分別安樂處死3 只小鼠，接種GY1774 和GY6952 的小鼠未觀察到明顯的大體病變，而在接種KM1135后5 d，左肺出現一個1 cm2×1 cm2的輕微充血灶。顯微鏡下觀察組織切片，發現KM1135 和GY1774 感染小鼠的鼻甲、氣管分別出現不同程度的氣管黏膜充血、水腫，黏膜上皮損傷、壞死，少量炎細胞浸潤。而GY6952 感染小鼠的鼻甲、氣管未見明顯的病變。3株病毒接種的小鼠，小鼠肺組織顯示，同程度小血管擴張充血、紅細胞滲出，炎癥細胞浸潤，肺泡壁和小葉間隔變寬等病理變化。

表3 H6N6病毒接種BALB/c后14 d血清抗體滴度

免疫組化檢測組織切片病毒NP蛋白，KM1135毒株感染的細胞較GY1774 和GY6952 多（圖1）。KM1135 毒株接種小鼠后3 d、5 d、7 d，大部分的小鼠的鼻甲、氣管支氣管以及肺組織流感病毒NP 蛋白陽性；GY1774接種的小鼠中，有1只鼻甲，另1只在氣管、支氣管中也能檢測出的病毒NP蛋白陽性，但在肺泡組織中未見NP 蛋白抗原表達。而GY6952 接種小鼠的鼻甲、氣管支氣管和肺組織均未檢測出NP蛋白。

圖1 免疫組化檢測H6N6病毒接種BALB/c小鼠后病毒NP蛋白

3 討論

H6亞型AIV在野生水禽和家禽廣泛流行，其宿主范圍已擴大到哺乳動物豬，已成為家禽、家畜地方性傳染病。分子流行病學調查顯示，我國2016—2019 年H6N6 亞型AIV 已在家禽（鴨、雞、鵝）中流行，其中在鴨分離率最高，而家禽鴨在AIV 跨種屬屏障傳播起重要作用[6]。流感病毒HA 蛋白頭部的受體結合位點可特異性地識別與結合禽型SAα-2,3Gal受體和（或）人型SAα-2,6Gal受體，但不同AIV亞型受體結合特異性轉變的分子機制并不完全相同。在H6病毒中，H6N1病毒的HA一些位點突變，如S137N、E190V、G228S突變在使病毒獲得人型受體結合能力過程中起到關鍵作用[7-8]。本研究3 株H6N6 病毒的HA 受體結合位點137、190、228 位點未發生突變，仍具有與禽源受體結合的特性。NA的突變或缺失可能有利于病毒適應新的宿主環境，從而突破宿主種間屏障[9]，Li 等[10]最近報道一些H6N6亞型AIV出現NA莖區氨基酸缺失，但本文所選的3 株鴨源病毒的NA 頸區未見突變或氨基酸缺失。PB2的T271K、E627K、D701N能提高多聚酶活性，有助于增強病毒對哺乳動物的致病性和傳播力，但在本實驗和文獻報道[5,11]中均未觀察到H6N6病毒的PB2 這些位點替換。上述基因測序分析提示，鴨源H6N6病毒仍屬于AIV的基因特點，特別是其HA與AIVSAα-2,3Gal受體結合。

家鴨易于接觸流感病毒“基因庫”—野生水禽，病毒在其體內適應后可將病毒傳播給陸禽或哺乳動物，因此，家鴨在流感病毒生態系統中起非常重要作用。那么，鴨源H6N6 病毒是否在哺乳動物復制、感染？本研究選擇上述鴨源H6N6 亞型AIV 接種BALB/c 小鼠。結果顯示，3 株鴨源H6N6 流感病毒可感染小鼠，其中，KM1135 病毒株最為典型。KM1135 病毒株接種小鼠后其呼吸道鼻甲、氣管和肺組織分離病毒陽性，組織病理檢查顯示小鼠氣管黏膜上皮細胞壞死、脫落，肺組織出現炎癥反應，呼吸道鼻甲、氣管至肺泡組織細胞內病毒NP 蛋白陽性，第14 天小鼠血清樣本抗體陽性，表明病毒能在小鼠體內有效復制并引起感染。GY1774病毒株接種小鼠后，少數小鼠呼吸道組織研磨液病毒分離培養陽性，病理學顯示小鼠氣管上皮細胞壞死脫落，但是肺組織未見明顯病理改變，2 只小鼠鼻甲或氣管、細支氣管上皮細胞內病毒NP蛋白陽性，而肺組織NP 蛋白分布陰性。本研究結果表明，一些鴨源H6N6病毒可以直接跨種屬感染小鼠，與Wu等[12]報道的一些H6N6病毒無需適應即可在小鼠有效復制的結果一致。因此，鴨源H6N6AIV 無需適應可以直接跨種屬屏障感染哺乳動物，甚至可能感染人。

2013 年5 月20 日，臺灣發現全球首例人感染H6N1 禽流感病例[13]，人感染H6N1 患者病例的出現，表明人群中的流感病毒的不可預測性和新發病毒的潛在威脅。研究表明，引起世界性大流行的流感病毒由AIV基因片段和人(或)豬基因片段重配演變而來[14]，但重配病毒中的AIV 不一定是高致病性AIV。而且，低致病性病毒感染引起的輕度癥狀容易被忽視，使病毒傳播、適應性改變和重配的機會增加。目前，防控流感大流行主要集中在引起人類嚴重疾病和死亡的AIVH5N1和H7N9亞型。然而，由于不可預知性和現有相關知識的缺陷，無法預測哪類亞型的流感病毒會導致下一次流感大流行，H6N6 亞型雖屬低致病性病毒，但其在禽類廣泛流行，有反復感染豬并發生變異進而演變成傳播人的新型流感病毒的潛能。因此，本研究證實，鴨源H6N6亞型流感病毒無需適應可跨種屬間屏障直接感染小鼠。提示必須持續、密切監測家禽H6N6 病毒的進化演變，以防其傳播給人。